嵌合型病毒樣顆粒疫苗的研究進展及藥學研發(fā)思路

凌 媛，李 敏

（國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022）

嵌合型病毒樣顆粒（cVLP）屬改良型病毒樣顆粒（VLP），可利用VLP 的組裝能力進行其他非自我組裝疫苗的研究，作為一種技術平臺，利用某些在形成VLP 起關鍵作用的組分，如以乙型肝炎病毒（HBV）核心抗原（HBcAg）為載體，在其有效部位插入其他病毒的外源抗原表位，形成一種多表位和多抗原的cVLP 疫苗。VLP具有獨特的免疫學特性，能通過影響抗原遞呈細胞發(fā)揮佐劑效應，可作為其他佐劑、多肽疫苗和核酸疫苗的整合平臺設計多種形式的疫苗，包裹核酸或其他小分子物質，以及作為分子運載工具靶向性遞送基因或藥物。此外，VLP 還可替代天然病毒在免疫學檢測中發(fā)揮重要作用。通過基因融合表達或化學偶聯(lián)的方法將外源抗原多肽與VLP 偶聯(lián)，構建cVLP 疫苗，可呈現(xiàn)除載體以外的其他病毒或腫瘤相關抗原表位，實現(xiàn)對多種病毒和腫瘤抗原的共同免疫，在預防病毒、治療腫瘤及過敏性疾病中發(fā)揮重要作用，部分研究已進入臨床試驗階段［1］。在此，著重介紹目前常用的VLP 載體病毒結構蛋白和噬菌體的應用情況。

1 常用VLP 載體

1.1 HBcAg VLP 載體

HBcAg VLP 是構建 cVLP 的常用載體。HBcAg 能形成VLP 的結構，同時自身具有免疫原性、免疫佐劑等特性，是理想的疫苗載體，因此HBcAg VLP 可用來呈現(xiàn)其他外源抗原，構建VLP 疫苗，用于抗病毒、細菌、瘧原蟲、腫瘤等疾病的動物試驗有良好的免疫效果［2］。Sominskaya 等、Apovia 公司和巴斯德以HBcAg VLP 為載體，分別構建了含HBV（前S1 蛋白）、丙型肝炎病毒（HCV，高度保守的N端核心表位）抗原、惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白中心重復序列和流感病毒M2 基質蛋白胞外功能區(qū)（M2e）的cVLP，動物試驗結果證明，cVLP 安全、有效［1］。

預防性乙肝疫苗的普遍接種，大幅降低了肝炎相關疾病的發(fā)病率，但仍亟待開發(fā)治療性乙肝疫苗。HBV 所致肝癌的發(fā)病率約占原發(fā)性肝癌的50%。有研究報道，利用HBV X 蛋白（HBX）能使腫瘤調節(jié)蛋白，在肝癌細胞中呈高表達狀態(tài)［3-4］。利用HBcAg 作為免疫載體蛋白，可將其他外源基因插入HBc 基因中，如上面提到的HBX細胞毒性T 細胞表位，或人類白細胞抗原（HLA）-DR結合表位（PADRE）等其他通用型T 細胞表位，通過構建這種嵌合基因，利用HBcAg 自我組裝能力進一步表達形成VLP，接種藥物的小鼠，在挑戰(zhàn)腫瘤30 d 試驗中可抑制腫瘤生長，同時誘導較強的T 細胞反應［3］。

有研究表明，機體對外源肽段免疫應答的強弱很大程度與肽段插入載體的位點有關，如HBcAg 位置（N 端、C 端或刺突部位）的影響。外源肽段的首選插入位點為HBcAg 的 78 ～83 位氨基酸位點主要免疫顯性區(qū)域（MIR），最多可容納120 個氨基酸殘基，可增強插入肽段的免疫原性；去除該區(qū)域某些特定的氨基酸殘基后，可能會降低 HBcAg 自身的免疫原性［5-6］。N 端截短 4 個以內的氨基酸，可連接最多50 個氨基酸殘基，外源肽段很少表達在HBcAg 顆粒表面；如果在N 端加入PreC 接頭，可促使外源肽段在顆粒表面表達［7］。C 端常在 144，149，156 位氨基酸位點插入，最多可連接100 個氨基酸殘基，可完全或部分表達在顆粒表面［2］。盡管在N 端和C 端連接的外源肽段的免疫原性不如插入刺突部位強，但HBcAg 自身依然保持很強的免疫原性，因此插入外源肽段的位點需根據不同目的而進行設計。如可在N 端或C 端連接HBV 的表位肽，構建抗HBV 的疫苗。通常在HBcAg 插入多個連續(xù)的B 細胞和T 細胞表位，能增強機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫應答。

1.2 噬菌體載體

目前，國內外已制備出多種噬菌體VLP，常用的噬菌體載體是以噬菌體Qβ 和AP205 為呈遞載體遞送各種外源抗原，主要用于非感染性疾病，如過敏、阿爾茨海默?。ˋD）、自身免疫性疾病、2 型糖尿病、腫瘤、高血壓、尼古丁依賴癥等，動物及人體臨床試驗結果顯示這種cVLP 具有一定的免疫性效果。瑞士Cytos 公司以Qβ 噬菌體VLP 為載體研制了系列治療性疫苗，包括AD 疫苗（CAD106）、尼古丁疫苗（NIC002）、過敏性哮喘疫苗（CYT003-QbG10）等，其中研制的針對血管緊張素Ⅱ的降壓疫苗（CYTOOe-AngQb）已完成Ⅱa 期臨床試驗［8-9］。經鼻內免疫小鼠以噬菌體Qβ 為載體的 cVLP，能有效誘導小鼠的黏膜免疫和系統(tǒng)性免疫應答；用其呈遞流感病毒M2 蛋白的胞外區(qū)域，經鼻內免疫后，能誘導小鼠產生較強的M2 特異性抗體反應和抗病毒作用［10］。

人類免疫缺陷病毒（HIV）gp41 蛋白高度保守的跨膜前域（MPER）可被某些單抗識別，因此可作為HIV 疫苗的中和靶點［11］。通過化學偶聯(lián)的方式將gp41 肽段轉載于噬菌體AP205 載體上構建cVLP，免疫小鼠可產生較高滴度的特異性抗體。根據選擇的不同肽段，免疫小鼠的血清可中和高敏感的HIV-1 實驗室毒株和不太敏感的原代分離株（不是C 群原代分離株），還具有抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）作用，表明其ADCC 表位可能位于 gp41 的遠端區(qū)域［11］。

另一種研究策略是將HIV CCR5 蛋白偶聯(lián)到噬菌體 Qβ 載體上，即將獼猴 CCR5（mCCR5）的 2 個肽段，1 個 N 端（EC1）或細胞外第二表面 loop 區(qū) （ECL2），與噬菌體 Qβ 融合表達，免疫 Qβ -EC1 或 Qβ -ECL2 后的恒河猴可誘導產生高滴度的抗CCR5 抗體。接種該疫苗的恒河猴在進行猴免疫缺陷病毒（SIV）攻毒時，其病毒載量低于對照組［12］。

1.3 人乳頭瘤病毒（HPV）L1 VLP 載體

因HPV L1 蛋白是具有二十面體衣殼顆粒的結構特征，其五聚體殼粒的規(guī)則排列保留了其構象表位，具有與天然病毒顆粒相似的構象表位，目前已上市的HPV 疫苗及其他在研疫苗基本是選擇重組表達L1 蛋白作為目的基因；由于其分子生物學及免疫學特性，HPV L1 蛋白還可作為其他感染性疾病及治療性疫苗的載體。將HPV16 型L1 的C 末端或N 末端部分截短，可插入一定長度的外源氨基酸序列，并不影響病毒樣顆粒的形成，可以用來構建cVLP 疫苗。

cVLP 既可表達自身載體的病毒衣殼蛋白，還可表達腫瘤相關抗原的T 細胞表位，并自行組裝成病毒樣顆粒。以HPV L1 為載體構建的cVLP 疫苗用于治療腫瘤等疾病，首先用于治療與載體本身密切相關的宮頸癌。GREESTONE 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，通過分子生物學技術將HPV E7 基因（位于HPV 基因的早期區(qū)，主要功能涉及DNA 復制、轉錄調節(jié)及細胞轉化，也是治療性HPV 疫苗的研究靶點）與 HPV16 型 L1 或 L2 基因的 C 端結合，通過昆蟲-桿狀病毒表達系統(tǒng)表達并提純后的重組蛋白，經透射電鏡可觀察到VLP 顆粒結構，動物試驗證明其具有抑制腫瘤生長的作用。卞繼峰等［14］通過pUC質粒構建了重組pUC19L1-E7，又進一步以重組腺病毒 rAd5 質粒構建 HPV16L1-E7，實現(xiàn)了重組HPV16 L1-E7 融合蛋白在293 細胞中的高效表達。Ⅰ期臨床試驗證實，感染了HPV16 型病毒并進展至宮頸上皮內瘤變（CIN）2／3 階段的患者中接近50%在接受最后一針的HPV16 L1-E7 cVLP 疫苗接種后，病灶可縮小50%［15］。另外，還有采用結合 HPV16 E6 和 E7 的 T 細胞表位的治療策略［15］。

除用于宮頸癌的治療外，利用HPV 載體還可表達其他腫瘤相關抗原，如人黏蛋白MUC-1（一種惡性腺瘤標志物）。利用HPV 載體表達的MUC-1 免疫小鼠，再用MUC-1+的淋巴瘤細胞系攻毒，免疫小鼠可獲得較強的T 細胞免疫反應，同時腫瘤進展也相應減緩［15］。

利用HPV16 L1 表達HIV 的相關疫苗研究中，曾將HIV gp160 的細胞毒性 T 淋 巴 細 胞（CTL）表位 肽（aa120 ～128，aa814 ～ 823）連接于 HPV16 L1 的 C 末端，構建具有VLP 結構的HIV 疫苗，其作為黏膜免疫疫苗口服，可有效誘導機體產生HIV 特異的黏膜免疫反應和CTL 細胞免疫反應，從而保護黏膜系統(tǒng)免受HIV 感染。

HPV 免疫原性具有型別特異性，因此有必要開發(fā)具有廣譜交叉保護作用的候選 HPV 疫苗。KANDA 等［16］采用 HPV16 型 L1 和 L2 的抗原表位構建 HPV cVLP 疫苗，即將L2 肽段呈遞于L1 蛋白組裝的VLP 表面，將構建的cVLP 疫苗免疫家兔后，可誘導其產生具有保護作用的針對L1 和L2 的中和性抗體，且中和抗體可針對高危型HPV18，31，52，58 型假 VLP 產生交叉中和作用［17］。

另外，將HPV45 L2 中和表位插入到HPV18 L1 的表面環(huán)區(qū)，構建cVLP（18L1-45RG1）。疫苗免疫后的家兔可產生針對 HPV39，45，68，70（屬 HPV45 和 HPV18同一支系）特異性的中和抗體。小鼠被動免疫該家兔血清后，可耐受 HPV18，39，45，68 型毒株的攻毒［18］。

有研究團隊分析了20 種型別HPV L1 的進化關系，并與其中8 種型別HPV 衣殼粒五聚體晶體結構保守性進行比較，發(fā)現(xiàn)型別特異性的優(yōu)勢中和表位是由表面的型別特異性氨基酸和VLP 保守性整體結構共同組成的；利用基于結構信息的同源替換方法，在一種經過分子改造的 3 型別 cVLP（HPV58 ／33 ／32）上實現(xiàn)了各型別HPV 抗原性和免疫原性的平衡，在非人靈長類動物體內誘導出3 倍劑量的與野生型混合VLP 相當的交叉免疫保護抗體滴度；利用晶體結構和冷凍電鏡（cryo-EM）結構測定揭示了cVLP 產生交叉保護的結構基礎。采用以上研究策略設計了 4 種3 型別 cVLP（HPV16 ／31 ／35，HPV56 ／66 ／53，HPV39 ／68 ／70，HPV18 ／45 ／ 59），通過分子設計的通用性驗證，目前已制備了7 種 cVLP，可應對 20 種 HPV 型別的感染［19］。

1.4 流感病毒VLP 載體

流感病毒VLP 是近年研究的熱點。流感病毒表位易發(fā)生基因漂移和突變，每年世界衛(wèi)生組織（WHO）均需預測年度流行毒株，并向企業(yè)發(fā)放在雞胚上的適配流感毒株，用于生產傳統(tǒng)流感疫苗。研究人員為制備具有廣譜保護作用的通用型流感疫苗，可利用VLP 載體表達來自不同流行毒株的HA 或NA 抗原表位，或聯(lián)合表達某些免疫刺激分子來增強流感抗原的免疫原性。

重組流感病毒cVLP 疫苗目前有采用異源病毒載體表達HA、NA 或M1 蛋白。在小鼠和雪貂試驗中，免疫H1N1 VLP 可保護動物產生針對同源流感病毒H1N1 的抗體，以及針對異源流感病毒H5N1 的攻毒［20］。與鼻噴免疫途徑相比，肌肉注射免疫途徑還可誘導動物產生高滴度的免疫球蛋白（IgG 和IgA）抗體，Ⅱ期臨床試驗中也顯示具有較好的耐受性［21］。另外，還有構建針對高致病性禽流感病毒H5N1 和H7N9 HA、NA 和M1 的重組cVLP，小鼠接種H5N1 cVLP 疫苗后，在經過同源或異源的H5N8 毒株的攻毒后能全部存活；雪貂免疫H7N9 cVLP 疫苗并聯(lián)合佐劑，可獲得針對H7N9 高滴度的中和抗體，肺組織的病毒載量和病毒脫落均較對照組低［22］。

除構建同源VLP 的研究外，還有利用昆蟲表達系統(tǒng)表達含流感病毒蛋白的逆轉錄病毒Gag 的cVLP，其大小和形態(tài)與逆轉錄病毒相似［23］。其他含流感病毒蛋白cVLP的研究中，有將HA 蛋白的胞內區(qū)、跨膜區(qū)和嚴重急性呼吸綜合征（SARS）S 蛋白胞外區(qū)連接構建嵌合基因，共表達該嵌合基因和流感病毒 M1 蛋白，形成 SARS-VLPs［24］，還有構建的水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）cVLP、呼吸道合胞病毒（RSV）-cVLP［25］、豬繁殖與呼吸綜合征病毒 cVLP［26］、禽流感病毒和新城疫病毒（NDV）雙價 cVLP［27］等。

另外，將HIV 多個gp41 表位，與流感病毒蛋白偶聯(lián)形成重組 gp41 三聚體（rgp41），其包含保守的gp41 表位，接種該疫苗的恒河猴可抵御13 次異源猴艾滋病毒（SHIV）攻毒，經肌肉或鼻內途徑接種該疫苗后的恒河猴均獲得了免疫保護，但肌肉注射組僅有50%個體受到保護［28］。

1.5 其他 VLP 載體

除以上常用VLP 載體外，還有采用貓皰疹病毒（FHV）、植物病毒如煙草花葉病毒（TMV）和馬鈴薯病毒X（PVX）等作為VLP 免疫載體。將HIV gp41 高度保守的表位（ELDKWA）采用基因融合的方式插入 PVX 的 N 端［29-31］。免疫該cVLP 的小鼠可產生針對HIV-1 MN gp160 衍生肽（H66）高滴度的 IgG 抗體，并能中和 HIV-1 病毒。此外，該疫苗聯(lián)合人樹突狀細胞（DCs）可觸發(fā)體內外周血單核淋巴細胞的增殖［29］。

2 cVLP 疫苗在防治腫瘤和慢性疾病中的應用

cVLP 疫苗除可用于預防 HBV、戊型肝炎病毒（HEV）、HPV、HIV 等病毒感染導致的疾病外，還可用于治療淋巴瘤、白血病、黑色素瘤和乳腺癌等腫瘤。腫瘤特異的表面抗原可刺激機體產生特異T 細胞和體液免疫反應，利用噬菌體和植物來源的病毒作為腫瘤抗原的遞送載體，該類載體在自然界中不感染人，也不會在人體中復制。利用TMV 的外膜蛋白或噬菌體Qβ 表達腫瘤相關表面碳水化合物抗原（TACA），該抗原本身免疫原性較低，而通過構建的嵌合TMV-TACA 則可以產生較高滴度的特異性抗體，同樣嵌合Qβ-TACA 也可獲得較強的體液免疫反應［32］。

還有表達全長人表皮生長因子受體-2（HER-2）或其他特異免疫表位的cVLP 疫苗用于乳腺癌的治療，目前已進入臨床試驗階段。它是將HER-2 外顯結構域肽段插入重組流感病毒體 （IRIVs）中［33-35］。其中 P4（378-394），P6（545-560）和 P7（610-623）3 個免疫肽段可有效激發(fā)B 細胞免疫反應［36］。臨床試驗結果顯示，有80%的接種者可獲得特異性抗體，70%的患者免疫后產生HER -2 特異性的IgG 抗體，另外還可觀察到細胞免疫反應，如白細胞介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、γ 干擾素（IFN-γ）細胞因子分泌增加［37］。另一種策略是先對包膜流感病毒VLP 進行修飾，將HER-2 錨定在糖基磷脂酰肌醇（GPI）上，由此構建cVLP（GPI-HER-2-VLP）。臨床前研究結果顯示，小鼠抗 D2F2 ／E2 （HER-2 陽性）血清 IgG 抗體增強，動物血清IgG1，IgG2a，IgG2b 水平也相應升高，最終達到輔助性 T 細胞（Th1和 Th2）反應的平衡。

還有采用小鼠多瘤病毒（MPyV）的主要衣殼蛋白（VP1）和次要衣殼蛋白（VP2）作為 VLP 載體的應用［38］。采用基因修飾后的 VP2 表達 HER-2 的N 端結構域（包含細胞外結構域和跨膜結構域）構建cVLP（VP2Her21-683），在桿狀病毒表達體系中可表達Her21-683Py cVLP 顆粒。免疫后的小鼠進行HER-2陽性D2F2／E2 細胞攻毒，87%的小鼠不會產生腫瘤。

利用植物病毒PVX 構建HER-2 陽性cVLP 疫苗的應用，將PVX 與含有HER-2 細胞外結構域氨基酸387-394 的P4 B 細胞表位進行化學偶聯(lián)，可誘導小鼠產生較單獨表達可溶性P4 更高滴度的HER-2 特異性抗體，該抗體可特異識別HER-2 陽性乳腺癌細胞［39］。

此外，還有針對高血壓和AD 等慢性病進行的主動免疫治療。將血管緊張素Ⅱ化學偶聯(lián)至噬菌體Qβ（AngQb）中，臨床前研究結果顯示，針對高血壓大鼠模型，接種該疫苗可誘導產生針對血管緊張素Ⅱ高滴度的IgG 抗體，血壓可恢復正常［40］。還有采用 HPV，噬菌體Qβ，HBc、BPV-1 等 VLP 載體來表達 AD 的 Aβ 肽。其中用HPV 偶聯(lián)Aβ 的N 端結構域可使機體產生高水平的抗體，其抗體滴度高于HPV 偶聯(lián)Aβ 的中間結構域或C 端結構域，表明Aβ 的N 端結構域具有重要的免疫原性。利用噬菌體 Qβ 與 Aβ1-6 進行共軛連接，免疫Qβ-Aβ1-6 后的小鼠可產生Aβ 肽特異性抗體，形成的斑塊比對照組少［41］。Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗結果顯示，47 例AD 患者在接受4 次皮下或肌肉注射CAD106 后，可誘導體內產生Aβ-特異性高滴度抗體［42］。

3 cVLP 疫苗的藥學研究

3.1 cVLP 疫苗的構建與設計

cVLP 的構建主要與中和免疫表位、展示載體的選擇、表位與載體的適配性等研究有關。通過中和表位選擇有效靶點，利用結構學的預測及分析，與VLP 載體構建cVLP，再通過生物學試驗方法（中和試驗和攻毒保護試驗等）篩選出具有中和抗體的cVLP，進一步對cVLP的免疫效果進行分析。中和免疫表位的選擇與表位長度、表位與載體的適配性有關，表位與載體適配性又與表位篩選、表位長度、嵌合位點及載體長度有關；展示載體的研究包括VLP 載體選擇、載體長度與嵌合位點的選擇有關；之后再通過結構學預測分析cVLP 的高級結構。

具體針對重組VLP 疫苗目的基因片段的選擇，其病毒流行株的選擇等是否合理，需結合對產品免疫原性、安全性及不同毒株間的交叉保護作用等方面進行綜合考慮。另外，目的基因序列的選擇需充分考慮對免疫原性、VLP 形成這兩方面的影響。針對多種蛋白構建的cVLP 疫苗的設計，不僅要考慮該疫苗所針對的蛋白，還需考慮對其他載體蛋白可能造成的影響［43］。將外源抗原插入可自我組裝的VLP 后能否有效表達，并使外源抗原在VLP 表面有效呈現(xiàn)，需進行表位與載體適配性研究，載體適配性主要是預測表位能否較好地嵌入到載體，以及形成的cVLP 結構是否穩(wěn)定，關系到疫苗整體的免疫原性。包膜VLP 可在自我組裝衣殼蛋白的基礎上以其天然構象呈遞外源抗原，而非包膜VLP 主要通過基因融合和化學偶聯(lián)的方式插入外源抗原，外源抗原的大小會影響VLP 的組裝和抗原的正確表達。

結構學預測是通過計算生物學、結構生物學和同源模建等方法分析cVLP 的高級結構。通過計算機輔助分析 cVLP 的抗體親和力，JOSHI 等［44］利用該方法在 HPV VLP 的EF 表面環(huán)成功表達了HBV preS1 抗原，證實其具有與天然HBV 親和強度相似的抗體。還有分子動力學模擬研究檢測分子間的相互作用（靜電作用和親、疏水特性）和結合能量的變化，預測cVLP 結構的耐受性和穩(wěn)定性［45］。該方法已對在小鼠多瘤病毒VLP 上插入流感抗原后的嵌合情況進行了分析，并將構建好的cVLP 用非對稱流分離系統(tǒng)和差示掃描量熱法進行驗證，結構與預測相符［46］。

cVLP 疫苗的設計也給RSV 疫苗帶來了新的研究思路。RSV 是有包膜單股負鏈RNA 病毒，根據G 蛋白抗原特異性分為 A、B 兩個亞型。1966 年，RSV 甲醛滅活疫苗（FI-RSV）免疫 2 ～ 7 月齡嬰兒，RSV 疫苗引起再次感染，被稱為RSV 疫苗增強性疾病（ERD），目前尚無可準確模擬人ERD 全部特征的動物模型，RSV 疫苗研究難點在于需保持免疫病理與免疫保護間的平衡，cVLP 疫苗可在有效靶點的研究基礎上，通過表位選擇，盡量規(guī)避引起免疫病理的區(qū)域位點。有研究通過RSV特有的結構DS-cav1 找到RSV 有效的中和性抗原表位，通過結構學測算設計構建多種cVLP，之后再利用F 蛋白帕利珠單抗酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法，高表達量及中和試驗等篩選出能誘導高滴度中和抗體的cVLP株，動物試驗具有較好的攻毒保護效力，且cVLP 免疫血清能產生相對均衡的IgG2a／IgG1 反應，提示能誘導相對均衡的Th1／Th2細胞免疫反應，cVLP 誘導的細胞免疫以IFN-γ 分泌為主。

3.2 VLP 載體與免疫表位的連接方式

抗原表位或其他免疫刺激分子可通過化學或生物偶聯(lián)的方式，以及基因工程技術引入到載體特定區(qū)域或病毒外殼蛋白的表面。

化學或生物偶聯(lián)方式是通過化學修飾方式插入載體，這種化學修飾方式主要是針對20 種天然氨基酸中的5 種，即賴氨酸（氨基官能團）、谷氨酸和天冬氨酸（羧酸官能團）、半胱氨酸（巰基官能團）和酪氨酸（羥基官能團）。如賴氨酸殘基中含量較高的親核官能團可與異硫氰酸酯或 N -羥基丁二酰亞胺（NHS）發(fā)生酯化反應。胺也可通過共價鍵連接到羧基上酰胺（肽）鍵，由羧酸選擇性偶聯(lián)，偶聯(lián)劑有碳二亞胺（EDC）。谷氨酸和天冬氨酸殘留物含有羧基，可使用EDC 修飾，與胺反應形成穩(wěn)定的酰胺鍵。半胱氨酸殘基中含有巰基，可與鹵乙?；蝰R來酰亞胺反應。酪氨酸殘基含有酚羥基，可由重氮偶聯(lián)進行修飾，這種修飾策略比上面列出的4 種反應更復雜［47］。

基因工程技術是將外源抗原插入到病毒衣殼蛋白表面，形成和病毒衣殼蛋白的基因融合形成cVLP，主要有直接融合、linker 融合及蛋白overcoat 3 種研究策略。直接融合是將外源抗原直接插入至衣殼蛋白的N 端或C 端［48-49］，將外源抗原提呈至衣殼蛋白表面 loop 區(qū)［50］。雖然呈遞的抗原常是選擇能被B 細胞識別的天然抗原表面loop 區(qū)的表位，但內部抗原在一些條件下更適合呈遞［51］。linker 融合是利用氨基酸短肽（如多個甘氨酸殘基）使外源抗原與衣殼蛋白相連接。每個衣殼蛋白單體一般具有堿性多肽域，如賴氨酸的—NH2，這些堿性多肽域朝向顆粒的外表面，短肽等小分子只要帶有合適的氨基酸基團，如—SH，可通過雙功能linker 結合并展示于VLP 表面，刺激機體產生抗體。蛋白overcoat 策略是利用手足口病毒（FMDV）2A 序列將外源抗原和衣殼蛋白序列相連接，在表達翻譯過程中可引起不一致的核糖體跳躍，實現(xiàn)天然衣殼蛋白和融合蛋白的共同表達，這種策略在當插入序列較大時可使融合蛋白表達在每一個衣殼蛋白的顆粒表面［52］。

3.3 結構確證研究

相比傳統(tǒng)疫苗，對重組cVLP 疫苗進行全面結構確證及質量特性研究是保證產品質量的重要方面，可參考基因工程重組產品的相關原則，對VLP 疫苗結構及質量特性的研究通常包括分子量（質譜法、電泳法，并與理論值比較）、純度、肽圖分析、肽指紋圖譜分析、N 端 ／C 端測序、等電點、圓二色譜、三維構象、中和表位研究、生物學活性等方面的檢測。由于cVLP 疫苗具備病毒樣顆粒的高級結構，其結構確證也存在與常規(guī)重組產品較大的不同，需結合影響疫苗免疫原性的質量特性，重視對VLP 的粒徑大小及結構完整性的研究。通過電鏡及動態(tài)光散射等方法分析VLP 顆粒的大小、分布及形態(tài)，最終保證組裝的VLP 顆粒的完整性和粒徑的均一性。

另外，在采用不同表達系統(tǒng)時，需通過結構確證研究對表達抗原翻譯后修飾進一步解析，如N-端乙?；?、脫酰胺基、二硫鍵、糖化（glycation）、降解等，均需進行相應的確證研究。

4 結語

高效的中和免疫表位和展示載體的選擇是cVLP疫苗設計成功的關鍵，單個表位的潛能可能有限，最理想的設計應是多表位的有機結合；表位與載體的適配性（包括長度范圍、嵌合位點等）也決定了形成cVLP 的結構及免疫效果。在一些病理機制尚不清楚的難研性疫苗研究中，cVLP 疫苗能提供一個新的研究思路，但其成功還需結合載體、佐劑及組合免疫等綜合考慮。值得注意的是，并非所有病毒均可開發(fā)構建成可自行組裝的VLP，作為cVLP 疫苗研發(fā)的遞呈載體。另外，從病毒結構的本身及選擇目的基因出發(fā)到結構蛋白的穩(wěn)定性等，均會影響可組裝為VLP 結構且具有良好免疫原性的VLP 疫苗載體的研發(fā)，這些均需充分研究和論證。