代謝組學在中藥質量評價和抗菌 抗炎作用機制研究中的應用△

唐才林，周洋，張榮菲，魏平，謝沛盛，廖弦，趙志敏，楊得坡*

1.中山大學 藥學院，廣東 廣州 510006；2.貴州省人民醫院 藥劑科，貴州 貴陽 550002；3.廣州至信中藥飲片有限公司，廣東 廣州 511430

近些年來，代謝組學在探討中醫藥治療效果，中藥品種差異、產地來源等因素對中藥質量的影響，中藥作用機制及潛在作用靶點等方面發揮越來越重要的作用。代謝組學是系統生物學的重要組成部分，也是最有潛力的系統研究方法。其主要以相對分子質量<1500 的小分子代謝物為研究對象[1]，對生物體中的代謝物進行全面的定性定量分析。該技術用于表征生物體為應對外界刺激而引起整體代謝物的改變，并且成功應用于許多領域[2]，如藥理學、臨床診斷和預后、毒理學、藥物作用機制、個體化醫療等[3-5]。生物體內小分子代謝物因化學結構多樣、含量差異較大、理化性質復雜，給代謝物的檢測帶來巨大挑戰。隨著質譜技術的發展進步，生物體中越來越多的代謝物得以準確檢出和識別，為各領域科研工作的深入開展提供支撐。

質譜分析是一種測量離子質荷比的分析方法，具有高靈敏度和高特異性的優勢，色譜則具備強大的分離能力，質譜與液相色譜聯用提高了代謝物鑒定和定量的靈敏度和分辨力，具有分析多種代謝物的通用性，兩者聯用是目前代謝組學樣品檢測的主要手段。質譜分析平臺的發展進步極大促進了代謝組學研究工作的開展，為檢測生物樣品中大量的代謝物提供了可能。當前代謝組學研究的技術平臺主要包括氣相色譜-質譜法（GC-MS）、液相色譜-質譜法（LC-MS）、核磁共振[6]、毛細管電泳-質譜法[7]、電感耦合等離子體質譜法[8]等。在這些檢測平臺中，GC-MS、LC-MS 和核磁共振是目前代謝組學研究中主要采用的檢測手段[6,9]。研究人員可以根據自己的研究目的及關注的代謝物類型選擇合適的分析檢測平臺，最大限度地發揮不同檢測平臺的優勢。

在代謝組學研究過程中，樣本采集和處理對研究結果影響較大，尤其在處理生物樣本時要特別小心，盡量減少取樣后殘留的酶活性或氧化過程造成代謝物的形成或降解，一般采用液氮凍結、冰甲醇淬滅等方式抑制生物樣本的代謝活動[10-11]。另外，可重復的樣品處理方法是代謝組學實驗成功的前提之一，有效的提取方法對代謝物的精確測量起著至關重要的作用。代謝物提取過程中需要考慮溶質與溶劑的相互作用，還要考慮溶質或被分析物與基體的分離等過程。因此，溶劑的選擇及基質在提取過程中的處理對代謝物的釋放有重要的影響，所用溶劑類型、基質的物理化學特性、pH 對基質的影響、基質和溶劑的接觸時間都將是代謝物提取過程中需要考慮的因素[12]。

質譜技術通過分析代謝物化學結構和質譜信號強度差異來實現對代謝物的鑒定和定量。色譜中的反相色譜包括非極性固定相和極性流動相，是最常用的分離方式，其中親水作用液相色譜和反相色譜與離子對試劑已經廣泛用于各種代謝組學研究。代謝組學后期數據處理主要采用多元統計分析結合化學計量學的方法，從海量數據中挖掘有價值的信息。數據處理過程主要包括峰提取、對齊、歸一化等預處理環節，這些數據處理環節可以借助一些專業的數據在線分析平臺或儀器廠商開發的商業軟件來完成，如MetaboAnalyst 5.0、Agilent Mass Hunter、Waters Progenesis QI、Compound Discoverer、XCMS 等[13-16]。此外，以主成分分析（PCA）[17]、分層聚類分析[18]、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）[19]為主的數據分析方法在代謝組學數據處理中均得到廣泛的應用。

1 代謝組學在中藥質量評價研究中的應用

1.1 在中藥品種與產地來源鑒定方面的應用

中藥材常注重道地性，道地藥材一般是指在特定地域（自然條件和生態環境）內所產的藥材，其品質和療效與其他地區所產同種中藥材相比更好，質量穩定可靠，并經過中醫臨床長期應用實踐優選而來。道地藥材品質佳、療效好，市場需求量巨大，但同時其市場價格相比于其他地區的同類藥材更高，在市場供求矛盾日益突出的情況下，部分商販為了謀取更大的經濟利益，常將道地和非道地藥材混合銷售，這嚴重損害了消費者合法權益，擾亂了市場經濟秩序。因此，對中藥品種和產地來源進行識別鑒定顯得十分必要。

不同品種藥材基因型不同，這是成百上千年自然選擇的結果，再受到產地生長環境長期的影響，逐漸形成了道地產區藥材獨有的形、色、氣、味特征，也形成了特有的代謝物指紋信息，這些信息將是識別藥材產地和品種來源的客觀依據。不同產地和不同品種藥材間的代謝物差異特征可以通過代謝組學的方法進行表征，再結合多元統計分析方法對代謝組學捕獲的數據進行分析，從而實現對中藥品種和產地來源的識別和區分[20]。

Mais 等[21]通過代謝組學方法成功區分了來自加納和中國的生姜樣品，找到能夠區分2 種樣品的化學標記物。Ghisoni 等[22]采用代謝組學結合多元統計分析方法對15 個榛子栽培品種進行識別，并對來自4 個主要種植區（智利、格魯吉亞、意大利和土耳其）6 個品種的地理來源進行區分。Yao 等[23]基于核磁共振氫譜（1H-NMR）方法區分枸杞的2 個品種，并用于枸杞質量評定。Li 等[24]借助代謝組學方法區分不同的貝母品種，該方法將5 種類型的貝母較好地區分為3組，同時發現并鑒定了18個代謝標記物，分析結果提示所研究的5 種類型貝母化學特征不同，應加以區分，以供臨床使用。還有學者基于直接實時分析飛行時間質譜的代謝組學方法成功辨別韓國和中國產的當歸樣品，該研究策略成為有效、準確識別韓國和中國產當歸地理來源的方法[25]。Liu 等[26]采用基于超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜法（UHPLC-Q-TOF-MS）的代謝組學分析法對33 份來源于姜黃屬4 個不同種的郁金藥材進行鑒別研究，根據PCA 和OPLS-DA 結果發現，來源于4 個不同種的郁金樣本化學成分差異明顯，姜黃素、莪術雙環烯酮、姜黃烯醇和莪術氧酮有可能分別是姜黃、溫郁金、廣西莪術和蓬莪術的獨有化學標記物。由此可見，代謝組學方法在中藥品種和產地識別研究方面具有較大潛力。

1.2 在中藥炮制方面的應用

炮制是許多中藥加工處理過程中的重要環節，可以起到減毒增效的作用，從而進一步提高中藥的療效和安全性。中藥所含的化學成分在炮制過程中必然會發生改變，通過代謝組學方法結合數據挖掘手段對炮制過程中改變的物質進行綜合分析，找到因炮制引起豐度顯著變化的物質，這些變化的物質可能是炮制發揮減毒增效的物質基礎。

莫毛燕等[27]利用1H-NMR 研究姜炭炮制前后對虛寒性出血癥大鼠尿液代謝表型的影響，代謝組差異分析結果表明，姜炭可以使因虛寒性出血證引發代謝紊亂的內源性生物標志物回歸正常水平，且效果優于干姜，這提示炮制后的姜炭作用效果的確優于炮制前的干姜。周國洪等[28]采用超高效液相-飛行時間質譜探討了王不留行炮制前后的代謝組變化，通過對代謝組學數據的統計分析，發現46 個初級代謝物發生顯著改變，且炮制對苯丙氨酸代謝途徑影響最大。文旺等[29]運用UPLC-Q-TOF-MS 分別采集甘草片、清炒甘草和蜜炙甘草的代謝物信息，采用多元統計分析獲取不同甘草炮制品間的差異性成分，共檢測到10 個質量差異標志物，以甘草酸和甘草苷衍生物為主。這些標志物可為甘草炮制品質量控制和炮制方法的改進提供參考。

1.3 在中藥品質評價方面的應用

絕大部分中藥來源于植物，具有植物生長發育過程的所有特征，不同產地的溫度、土壤、光照、降雨量等環境因素必定會對植物代謝物的產生和積累帶來影響，而植物代謝物往往又是其藥用功效和品質的直接體現。因此，中藥的品質問題與植物代謝物種類和含量密切相關。代謝組學技術可以對植物代謝物實現高通量測定，從化學組成層面客觀體現中藥化學成分差異，從而反映藥材的藥效差異。

鄧靜等[30]基于GC-MS 代謝組方法，對不同表型單面針和兩面針初級代謝產物進行分析，研究表型差異對初級代謝產物影響的機制，研究結果表明，兩者初級代謝物差異較大，進一步分析得到5 個高度相關的差異標志物，分別是奎寧酸、D-塔羅糖、丙三醇、D-葡萄糖和D-果糖；代謝通路富集結果表明，苯丙氨酸途徑、果糖和甘露糖代謝、糖酵解及淀粉與蔗糖代謝是兩者主要差異代謝通路，其中的苯丙氨酸途徑是植物界中生物堿合成的主要途徑之一，由此推測這可能是單面針和兩面針生物堿含量差異的主要因素之一。彭克忠等[31]借助1H-NMR 代謝組分析平臺，建立手參藥材整體1H-NMR 指紋圖譜，從代謝物水平系統分析不同產地手參藥材初生和次生代謝產物差異，鑒定了14 個化合物，其中天麻素、對羥基苯甲醇、丙氨酸等是不同產地手參的主要差異代謝標志物，從而實現對不同產地手參質量的整體評價。Cui 等[32]采用GC-MS 代謝組學平臺，分析了浙貝母不同部位的化學成分差異，鱗莖是浙貝母重要的藥用部位，研究發現，更多種類的營養成分常儲存于鱗莖中，為再生葉和莖的生長提供營養。因此，為了促進鱗莖的生長，花、尖葉和尖莖需在3 或4 月份被摘除。Yao 等[33]采用比較形態學結合代謝組學分析方法，對來自中國4個主產區的51份枸杞樣品進行了分析，發現季風、高原、干旱和半干旱地區的枸杞不僅果實形態不同，而且抗氧化活性、含糖量也有所差異，建議根據枸杞特定的形態和化學特征將來自不同地區的枸杞用于不同的目的，產于高原個頭大的枸杞適合作為新鮮水果銷售，抗氧化活性高且帶有苦味的枸杞建議作為藥用。

中藥品質的影響因素是多方面的，傳統經驗鑒別往往通過判斷中藥材的形、色、氣、味特征來識別其質量，但這一般需要具有豐富的實踐經驗積累。隨著現代檢測分析技術的發展，用于開展中藥品質評價工作的方法越來越多樣，特別是基于質譜方法的代謝組學技術的快速發展，為中藥材品質評價提供了新思路。

2 代謝組學在中藥抗菌作用研究中的應用

長期以來，抗生素的不合理和不規范使用使得各種耐藥菌加速產生，細菌耐藥已經被世界衛生組織（WHO）列為重大公共衛生事件，并呼吁世界各國積極采取有效措施共同遏制細菌耐藥[34]。相比非耐藥的同類細菌感染，耐藥菌感染的患者死亡風險高，治療困難，也將消耗更多的醫療資源，必定會帶來更高的醫療成本。研發新型抗生素難度越來越大，研發速度遠遠趕不上細菌的耐藥速度[35]。中醫藥對于細菌感染性疾病的治療有獨特的優勢，中藥活性成分眾多，不易產生耐藥性，為感染性疾病的治療提供了新的思路[36]。

一些中藥能夠抑制細菌的生長和繁殖，通過多靶點、多途徑發揮抗菌作用，通過代謝組學方法研究中藥抗菌作用過程，不僅可以從代謝角度認識中藥抗菌作用機制，而且對細菌的耐藥代謝機制也有進一步的了解。通過對具有潛在抗菌活性化合物或者中藥提取物進行代謝組學分析，能夠進一步明確其抗菌作用代謝途徑，發現新的抗菌作用靶點和途徑，為新型抗菌藥物的開發提供參考。

Xu 等[37]報道了茶樹油通過抑制三羧酸（TCA）循環中的關鍵代謝酶，提高過氧化氫水平，引起細胞膜內物質滲漏，導致線粒體功能紊亂和氧化應激的發生，從而抑制灰霉菌的生長。有學者基于LC-MS的代謝組學技術研究巴拉圭茶水提物對鼠傷寒沙門菌的作用，結果發現，巴拉圭茶水提物可以誘導鼠傷寒沙門菌的中心碳代謝改變，包括對TCA 循環和糖酵解通路的影響，降低過氧化氫酶活性，降低的TCA循環可能最大程度阻礙還原型輔酶Ⅰ（NADH）產生，最終達到抑制細菌生長的目的[38]。Chen 等[39]采用GC-MS 非靶向代謝組學技術，探討了香樟揮發油抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的作用機制，結果表明，香樟揮發油通過破壞細胞膜、誘導細胞凋亡、干擾氨基酸代謝等途徑發揮抗菌作用。Liu 等[40]通過代謝組學技術比較了頭孢他啶耐藥溶藻弧菌和頭孢他啶敏感溶藻弧菌之間的代謝差異，結果表明，在頭孢他啶耐藥溶藻弧菌中，丙酮酸循環和呼吸作用效率降低，脂肪酸生物合成增加，膜質子動力勢降低，這些發現有助于加深對細菌耐藥機制的理解，為開發更加有效的策略來治療、管理和預防因抗生素耐藥菌引起的感染提供了有意義的探索。

3 代謝組學在中藥抗炎作用研究中的應用

炎癥是機體抵抗外界刺激做出的一種防御性反應，在組織再生和修復中起著關鍵作用[41]。然而，過度的炎癥反應會嚴重影響機體的正常運轉，與腫瘤、糖尿病、哮喘等疾病的發生發展密切相關[42-43]。借助代謝組學技術研究抗炎藥物，探討其作用機制，篩選潛在的作用靶點，為抗炎藥物開發和臨床應用提供理論支撐。

Yuan 等[44]用血清代謝組學揭示連翹水提物和精油對卡拉膠致水腫大鼠的抗炎作用機制，血清分析中發現13 個改變的生物標志物，連翹精油則影響鞘磷脂代謝、甘油磷脂代謝，連翹提取物和精油通過影響與炎癥通路相關的特定作用靶點來恢復體內代謝紊亂狀態。Wei 等[45]采用UPLC-Q-TOF-MS 代謝組學方法，以關節炎模型大鼠尿液為分析樣本，探討甘草黃酮成分治療類風濕性關節炎的作用機制，通過比較模型組和黃酮處理組代謝物變化，找到20 個潛在的且與嘌呤代謝、牛磺酸和次牛磺酸代謝、色氨酸代謝、苯基丙氨酸代謝和TCA 循環相關的生物標記物。Liu 等[46]采用代謝組學手段分別評估了甘草黃酮對脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7 炎癥模型的抗炎效果，研究發現，與脂多糖模型組比較，甘草黃酮處理的RAW264.7 細胞代謝譜更加趨近于對照組，提示甘草黃酮處理后可以逆轉脂多糖造成的一些影響。Zhong等[47]用角叉菜膠誘導急性炎癥模型大鼠，給予不同炮制品當歸揮發油，運用GC-MS代謝組學方法測定炎癥滲出物和血漿樣本的差異代謝物，結果表明，當歸揮發油可以顯著抑制前列腺素E2（PGE2）、組胺（HIS）、5-羥色胺（5-HT）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子的釋放，檢測并鑒定到14 個潛在生物標記物，且在炒當歸揮發油組和酒制當歸揮發油組中變化最為顯著。Chen等[48]采用GC-MS 代謝組學方法探討了香樟揮發油抗炎作用機制，研究表明，香樟揮發油可以顯著降低小鼠小膠質細胞BV2一氧化氮（NO）釋放和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，同時還能降低脂多糖誘導的炎癥細胞因子mRNA 表達和分泌水平；進一步的代謝組分析發現了39 個差異代謝物，顯著富集到了5 條代謝通路，與對照組相比，脂多糖組培養上清液中葡萄糖水平降低，乳酸水平升高，而經過香樟揮發油處理后逆轉了葡糖糖和乳酸的變化趨勢，且香樟揮發油組中糖酵解關鍵代謝酶活性降低，表明香樟揮發油可能通過削弱BV2 細胞的糖酵解代謝水平發揮抗炎作用。補肺湯具有補肺益氣、止咳平喘的功效，主治肺虛咳喘、短氣自汗等證，對治療過敏性支氣管炎具有一定效果，Shi等[49]以家兔為實驗動物模型，采用代謝組學方法研究補肺湯對過敏性支氣管炎的治療效果，代謝組學分析發現，在過敏性支氣管炎模型組家兔血清中，蘋果酸、葡萄糖酸和纈氨酸豐度升高，半乳糖、硬脂酸、吡喃葡萄糖豐度降低，這些變化的物質可以成為過敏性支氣管炎的生物標志物，但是經過補肺湯治療后，上述7 個生物標志物出現了不同程度的逆轉，從代謝層面說明，補肺湯的確具有改善過敏性支氣管炎的作用。苗雨露等[50]采用1H-NMR 代謝組學技術結合免疫印跡法探討還陽參抗炎作用機制，代謝組學分析找到了4 個顯著性相關的代謝物（琥珀酸、蛋氨酸、甘氨酸和肌酸）；對1H-NMR 圖譜采用多元統計分析，結果發現，還陽參水提物組和陽性對照組均向空白組靠近，表明還陽參水提物能有效緩解大鼠的炎癥癥狀，發揮抗炎效果。

由此可見，代謝組學方法在中藥抗炎作用研究方面得到廣泛應用，從代謝組角度闡述中藥抗炎的作用過程，為開展中藥抗炎機制研究提供了新的思路。代謝組學通過比較炎癥模型組、對照組和給藥組的代謝譜，尋找差異代謝物，并借助生物信息學、化學計量學、相關性分析等數據分析方法，進一步揭示差異代謝標志物與生物學功能和表型之間的關系，從而表征藥物抗炎過程中相關代謝物的變化，以及差異代謝物與炎癥指標之間的相關性，為發現與抗炎作用調節相關的代謝物和潛在作用代謝途徑提供技術支撐。

4 結語與展望

代謝組學技術在中藥質量控制、品質評價和抗菌抗炎作用機制研究方面具有廣闊的應用前景，該技術以獲取高質量質譜數據為基礎，結合多樣化的數據處理方法，找到與實驗目的相關的生物學信息。中醫藥治病強調整體觀和辨證論治，特別是中藥復方更加突出體現藥物的整體藥效，作用機制網絡非常復雜，傳統一對一單靶點的研究方法已經不能滿足中藥復雜機制的研究需求，而代謝組學具有整體性和系統性的特點。因此，代謝組學在中醫藥研究領域具有自己獨特的優勢，能夠發現其他組學不能發現的信息。

盡管代謝組學技術的應用領域越來越廣泛，但基于目前的技術水平，其局限性和不足之處也逐漸凸顯。隨著質譜技術的快速發展，能夠檢測到的物質越來越多，但是物質解析能力還有待提高。尤其是非靶向代謝組學研究，需要嚴重依賴質譜數據庫進行后續物質的鑒定分析。對于生物體內成千上萬的代謝物而言，在質譜數據庫中，具有標準譜圖的物質并不多，許多物質是沒有標準譜圖且無法獲得相應標準物質，這就給物質鑒定帶來極大困難。為了解決這一問題，近年來科研人員通過不斷改進代謝物鑒定算法提升代謝物鑒定能力[51]。同時也在改變研究策略，從檢測代謝物靜態變化到檢測代謝物在生物體內的動態變化，基于同位素標記的代謝物追蹤技術可以實現體內代謝物動態變化檢測，這為了解代謝物在生物體內整個變化過程和流向提供了可能[52]。

檢測技術的不斷發展進步是必然的，這將更加有利于解決越來越復雜的問題，為推動中醫藥作用機制研究、中藥質量標準制定等工作提供強大的技術保證。在中醫藥現代化、標準化研究過程中，既要繼承和發揚中醫藥的優勢，也要善于借助現代研究技術手段，在用現代科學語言闡述中醫藥發揮作用的同時逐漸形成一套具有中醫藥自身特色的研究模式。