絲膠蛋白及其復合材料在軟骨和骨組織工程中的研究進展

劉蘋 戴夢男 李蒙 宋慧 龔佳俊 殷音 王建南

摘要： 骨/軟骨組織工程是結合醫學與材料科學開發支架材料來治療或替換壞損骨/軟骨。絲膠蛋白生物學性能優異，在骨組織修復和軟骨組織再生方面應用潛力巨大。研究顯示，絲膠蛋白基骨組織工程支架可以促進細胞黏附與增殖、刺激膠原蛋白生成、并為磷酸鈣提供成核位點來促進羥基磷灰石沉積;其溶液-凝膠轉變特性為包埋的細胞提供合適的生存環境。因此，文章綜述了絲膠蛋白及其復合物在骨/軟骨組織工程中的研究背景，重點闡述了絲膠蛋白材料的制備、生物礦化、與干細胞相互作用及對惰性金屬骨移植物表面修飾等方面的研究進展，并對今后絲膠蛋白在骨和軟骨組織工程方面的研究方向和發展做出展望。

關鍵詞： 絲膠蛋白;骨;軟骨;復合材料;組織工程;組織再生

中圖分類號： TS101.4;Q189

文獻標志碼： A

文章編號： 1001-7003（2021）12-0001-07

引用頁碼： 121101

DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2021.12.001（篇序）

Abstract： Bone/cartilage tissue engineering is the combination of medical science and material science to develop scaffold materials for the treatment or replacement of bone/cartilage defects. Sericin with excellent biological properties has tremendous potential in bone/cartilage tissue repair and regeneration. Studies have shown that sericin-based bone tissue engineering scaffold can promote cell adhesion and proliferation， stimulate collagen production， and provide nucleation bond for calcium phosphate to promote hydroxyapatite deposition. The solution-gel transition characteristics of sericin provide a suitable living environment for the embedded cells. Therefore， this article reviewed the research background of sericin and its composites in bone/cartilage tissue engineering， emphasized on the research progress in the sericin materials preparation， biomineralization， interaction with stem cells， and surface finishing on inert metal bone grafts. Finally， the article prospected the future research direction and development of sericin in bone/cartilage tissue engineering.

Key words： sericin; bone; cartilage; composite material; tissue engineering; tissue regeneration

骨骼是人體內最重要的組織之一，能夠提供機械支持，并在維持離子平衡方面發揮重要作用[1]，軟骨為關節運動提供所必需的結構和力學支持。意外事故和自身機能老化等都會造成骨缺損[2]，并且隨著人均預期壽命的增加與人口老齡化現象嚴重，人群中骨科疾病的發病率越來越高[3]，對骨/軟骨缺損修復的需求和難度也越來越大。據統計，全世界每年有約890萬人發生骨科疾病[4]，超過2 700萬人有軟骨損傷造成的骨關節炎疾病，截至2020年年底，中國骨科植入醫療器械行業市場規模約為304億元[5]。

大部分的骨/軟骨缺損都可以自我再生與修復，但是當損傷范圍超出自身的再生能力時則需要進行骨移植，自體或異體骨移植是目前臨床上最有效的方法[6]，但需要進行手術獲取組織，這可能導致供體部位出現損傷、畸形和瘢痕，也可能會導致出血、炎癥或感染。異體骨移植還具有疾病傳播和免疫排斥等潛在風險，應用受到限制。如果缺損過大，則供體來源可能不足，大多數缺損不能完全修復[7]。其他方法例如關節鏡下清創術、微骨折術、鑲嵌成形術等[8]，也存在供區缺陷、感染和免疫反應及供區來源有限等問題[9]。鑒于以上的缺點和限制，骨/軟骨組織工程越來越受到材料和醫學科學家的極大關注，也呈現出極具潛力的應用前景。

1?骨/軟骨組織工程

骨/軟骨損傷的再生與修復是一個復雜的過程，不同類型的細胞、信號分子和基質蛋白共同作用于修復骨/軟骨缺損。骨/軟骨組織工程是一種最有希望的治療方法[10]，即將細胞接種在與天然骨/軟骨性能相近的組織工程支架中，支架可作為細胞或生長因子的載體，體外培養后植入或體內誘導干細胞向骨/軟骨細胞分化[11]，或將組織工程支架植入捕獲細胞/干細胞定植或分化。組織工程支架不僅可以為誘導骨/軟骨缺損的再生與修復提供適宜的環境，還維持一定的空間結構和機械強度，為骨/軟骨再生提供基本條件[12]。因此，作為支架的材料是骨組織工程的關鍵。

關于骨/軟骨組織工程最早的研究可以追溯到19世紀初，醫生嘗試將磷酸鈣用做骨移植材料[13]。隨著材料的開發和研究技術的發展，組織工程材料從生物惰性材料（合成聚合物為主）開始向生物活性材料（天然聚合物為主）轉變。生物活性材料可以為組織再生提供特定的結構，并增強與細胞之間的聯系，以誘導受損組織再生與修復，但力學性能通常達不到要求。合成聚合物是當前骨/軟骨組織工程研究的主要材料，可大規模生產和精確制造幾何形狀，通常力學性能優異但生物學性能欠佳，多數不降解或降解有可能產生一定的毒性。臨床上廣泛應用的金屬材料是一種重要的骨移植材料，具有比組織工程材料更佳的力學性能，由于力學性能遠高于天然骨，所以植入后不利于與骨組織之間的整合[14]。當前常用的骨/軟骨組織工程支架材料如表1所示。

絲膠蛋白由于其優異的生物學性能，在生物醫學領域受到了越來越多的關注。近年來，許多研究都在探索絲膠蛋白在骨/軟骨組織再生中的應用。本文綜述絲膠蛋白在骨/軟骨組織工程中的研究進展。

2?絲膠蛋白

2.1?絲膠蛋白的組成

絲膠蛋白源于蠶絲，資源非常豐富，通常隨著工業廢水排出，造成了極大的浪費和環境污染。絲膠蛋白是由蠶的中部絲腺合成（圖1，參考文獻[39]重新繪制），當蠶的后部絲腺合成的絲素蛋白遷移至中部絲腺時，絲膠蛋白與絲素蛋白復合并包裹在絲素蛋白外圍（圖2）。絲膠蛋白占蠶絲質量的25%～30%[40]，是一種水溶性球狀蛋白，相對分子質量約為24～400 kDa，主要由18種氨基酸組成，其中含量較多的氨基酸為絲氨酸（Ser）和天門冬氨酸（Asp），分別約占33%和20%[16，41]。

絲膠蛋白的產量、相對分子質量，以及理化性質和生物活性都取決于其制備方法，目前常用的絲膠蛋白獲得方法有高溫熱水法[16]、溴化鋰法[42]、高壓法[43]、碳酸鈉法[44]、尿素法[45]及酸析法[46]等。

2.2?絲膠蛋白的生物學性能

天然的絲膠蛋白分子以無規線圈結構為主，是一種無定形材料。絲膠蛋白肽鏈上具有大量的氨基、羧基、羥基，使其具有許多優良的生物活性及功能改性的結構基礎[47]。絲膠蛋白可抑制促炎因子的釋放，減少炎癥的發生，具有低免疫原性[44];絲膠蛋白可以代替培養基中的胎牛血清為細胞提供營養，促進細胞增殖，具有良好的生物相容性[48];絲膠蛋白可以清除細胞內的活性氧，抑制細胞凋亡從而具有抗氧化的效果[49];還有研究指出，絲膠蛋白具有原位熒光特性，為追蹤絲膠蛋白材料在體內的變化提供便利[50]。

絲膠蛋白還具有保濕、美白和防曬等功效，是一種優質的化妝品添加劑，在美容護膚行業備受青睞[51]。除此之外，絲膠蛋白具有8種人體必需氨基酸，安全無毒，在功能性食品開發方面也有廣泛的應用[52]。近年來，絲膠蛋白材料及其復合材料在生物醫學和組織工程方面展現出了令人驚喜的應用潛力。其應用研究，包括用作干細胞和生長因子的載體、藥物緩釋基質及惰性移植物的涂層材料等已有較多的報道。

3?絲膠蛋白作為骨/軟骨組織工程材料的研究進展

絲膠蛋白作為骨/軟骨組織工程支架有水凝膠和多孔材料兩種最主要的形式，其中水凝膠常用于軟骨組織工程。絲膠蛋白中大量的絲氨酸和天門冬氨酸，所含親水性基團—OH和—COOH賦予了絲膠蛋白高度親水的性質，使其成為水凝膠制備的理想材料（圖3）。同時可裝載基因片段和小分子藥物，用于仿生細胞外基質。形成絲膠蛋白水凝膠簡單可行的物理方法有自組裝法[18，20，40]和超聲法[53]，除此之外，化學交聯也常用于制備絲膠蛋白凝膠支架，常用的化學交聯試劑如戊二醛、京尼平等[15，17，21]。近年來，由于酶（如辣根過氧化物酶）催化反應制備的材料溫和、無毒，已引起越來越多的關注[54]。

經凍干制備的絲膠蛋白海綿狀多孔材料常用于骨組織工程支架[19，55]（圖3），冷凍干燥法通過冰晶的升華作用在三維支架內形成孔隙，材料完全可在水系環境中制備，避免了有機溶劑的使用。

除此之外，絲膠蛋白也可制備成膜材料來支持骨細胞的黏附和增殖[22]。絲膠蛋白中大量的極性基團便于與功能化的鈦基質表面結合進行涂層改性，也是提高金屬骨移植物生物活性的常見方法[35-36]。

3.1?3D絲膠蛋白支架

絲膠蛋白水凝膠含水量高、彈性好、生物大分子易擴散，網絡結構良好，并能以極小的創口進行注射，與骨/軟骨缺損形狀相適應。絲膠蛋白本身也可作為細胞存活和增殖的營養來源，為骨/軟骨組織再生提供基礎[56-57]。Qi等[23]通過光交聯制備了甲基丙烯酸絲膠蛋白水凝膠，接種的軟骨細胞在該水凝膠中黏附、增殖良好，且其降解可以為細胞生存提供營養。將水凝膠皮下注射進雌性小鼠背部，結果顯示該水凝膠內軟骨細胞產生的細胞外基質主要成分糖胺聚糖和Ⅱ型膠原的含量明顯提高，軟骨形成標記物SOX9、Ⅱ型膠原α1和聚蛋白聚糖也都顯著提高，并且其楊氏模量可達到2.53 MPa，接近于天然軟骨。Chen等[17]制備了殼聚糖/絲膠蛋白/羥基磷灰石復合水凝膠，絲膠蛋白的加入使水凝膠的彈性模量和抗壓強度增加，并且可以促進接種在材料上的人骨肉瘤細胞增殖。

絲膠蛋白多孔材料具有良好的吸水能力、降解能力等，孔隙結構為成骨細胞提供適宜的生長空間。方艷等[19]制備出絲膠蛋白/羥基磷灰石/聚己內酯復合支架材料，該復合材料良好的孔隙結構能滿足骨細胞生長和黏附的要求，并未顯示出細胞毒性，可作為骨組織工程支架作進一步研究。王琳婷等[24]制備了不同配料比的絲膠蛋白/羥基磷灰石復合支架，當絲膠蛋白與羥基磷灰石質量比為5︰5時，支架具有最佳的機械性能和熱穩定性，但孔隙率較低，不適宜細胞生存。

3.2?礦化模板

骨是自然界中生物礦化最復雜的材料之一。生物礦化是指由生物體中基因、細胞、蛋白和基質等有機體逐級調控生成無機礦物復雜的分級過程[58]。對骨組織工程來說，支架材料能誘導礦化、引導骨組織再生，并滿足結構與機械性能的要求至關重要。絲膠蛋白中大量帶負電荷氨基酸提供的—COOH可作為Ca2+的結合位點，已有研究證明絲膠蛋白礦化能夠促進羥基磷灰石沉積[25-26]，且絲膠蛋白能調控沉積的羥基磷灰石的晶體大小和形態[59]。

Zhang等[22]嘗試在絲膠蛋白膜表面進行體外礦化試驗，使磷灰石礦物在絲膠蛋白膜上沉積，隨著礦化時間的延長，磷灰石礦物的沉積增多，雖然使得絲膠蛋白膜變硬變脆，但增加了播種在膜上的人骨肉瘤細胞的活力。Griffant等[10]利用膠原和絲膠蛋白制備了可注射水凝膠，不僅復合水凝膠中的細胞代謝活性明顯高于純膠原支架，而且體外礦化研究發現40%絲膠的摻入是促進礦化的最佳濃度，并且在第14天時羥基磷灰石沉積量接近90%。田偉[16]使用沸水脫膠方法制備了絲素/絲膠蛋白復合膜和多孔材料，兩種材料在模擬體液中的礦化結果均顯示，沸水脫膠時間較短（絲膠蛋白含量較多）的絲素/絲膠蛋白復合材料上的磷灰石礦物沉積明顯高于脫膠時間較長（絲膠蛋白含量較少）的復合材料，說明了絲膠蛋白相比于絲素蛋白，更能促進磷灰石礦物的沉積。Veiga等[27]制備了羥基磷灰石/絲膠蛋白納米復合材料，也指出復合材料中隨著絲膠蛋白濃度的增加，羥基磷灰石沉積速度明顯提高。Yang等[25]和Zhuang等[26]也都證明了絲膠蛋白可作為羥基磷灰石沉積和生長的模板，進一步促進人骨髓間充質干細胞的成骨分化。

3.3?干細胞支架材料

為了克服自體骨或異體骨移植的局限性，科研人員更深層次地探究基于細胞的治療方法，而干細胞為最佳選擇。干細胞是具有多向分化潛能、自我更新能力的細胞，是細胞起源最原始細胞[60]。組織工程常用的干細胞有胚胎干細胞和間充質干細胞，但胚胎干細胞的獲得具有一定倫理學上的爭議，故研究受限。而間充質干細胞可來源于骨髓、脂肪、臍血、外周血及肌肉組織等，獲取相對容易，并且在特定條件下可向不同組織的細胞分化[61]。目前，骨/軟骨組織工程中關于干細胞的研究越來越多，常用的是骨髓間充質干細胞[20，28-29]，脂肪間充質干細胞也有報道[15]，而其他間充質干細胞在骨/軟骨組織工程中的應用鮮有報道。

Dinescu等[15]分別制備了透明質酸/絲膠蛋白/膠原和硫酸軟骨素/絲膠蛋白/膠原凝膠支架，指出兩種支架均可為脂肪間充質干細胞的黏附、增殖和成軟骨分化提供適宜的環境，可望作為軟骨組織工程支架作進一步研究，但添加達10%硫酸軟骨素時復合水凝膠支架具有明顯的細胞毒性。Wang等[20]通過基因工程技術將血小板源性生長因子PDGF-BB整合到絲膠蛋白的基因組中，使蠶吐出的蠶絲具有功能化的絲膠蛋白并且制備的絲膠蛋白水凝膠可以支持骨髓間充質干細胞的黏附和增殖，并顯示出高的成骨細胞分化能力。他們將接種了骨髓間充質干細胞的水凝膠皮下注射進裸鼠側腹，發現PDGF-BB功能化的絲膠水凝膠的骨形成更明顯。Pankongadisak等[18]制備了殼聚糖/絲膠蛋白/磷酸甘油酯復合水凝膠，該水凝膠對小鼠胚胎成骨細胞前體細胞無細胞毒性，并可以提高細胞在水凝膠上的黏附和增值。Qi等[28]制備了絲膠蛋白/氧化石墨烯復合水凝膠，該水凝膠生物相容性、力學性能和降解性能優異，進一步將水凝膠植入小鼠顱骨缺損部位，發現氧化石墨烯/絲膠蛋白復合水凝膠可以促進自身的骨髓間充質干細胞遷移到損傷部位，不需要外源性刺激便可誘導干細胞成骨分化來進行骨再生。同樣，Yuan等[29]在絲膠蛋白/還原氧化石墨烯納米復合材料中接種骨髓間充質干細胞，細胞中反映軟骨形成能力的總膠原、糖胺聚糖和Ⅱ型膠原分泌水平均明顯提高，標志著材料中的骨髓間充質干細胞已向軟骨細胞分化，認為該復合材料有望用于膝關節軟骨的修復。

3.4?金屬骨移植物涂層

鈦及其合金無毒，具有良好的機械性能[62]，作為骨科、牙科植入物、髖關節置換裝置的關鍵材料，在生物醫學領域的應用較為廣泛。然而，金屬骨植入物缺乏生物活性且易受細菌感染，在體內穩定性差還易誘發并發癥[63]。絲膠蛋白優異的生物學性能可以用于金屬骨的改性。Nayak等[35]為了活化鈦基質，將絲膠蛋白和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的三肽序列涂覆于基質表面。在生物體中，細胞與基質及周圍細胞的接觸是由細胞黏附受體介導的，而整合素就是數量最多、用途最廣的受體。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的三肽序列是最小的細胞黏附肽序列，存在于多種細胞外基質中，可與多種整合素特異性結合，促進細胞與細胞外基質及細胞間的黏附作用。研究發現，絲膠蛋白涂覆提高了鈦基質的生物活性，促進了小鼠成骨細胞的黏附、增殖和分化能力。該研究組進一步將小鼠巨噬細胞單獨接種或小鼠巨噬細胞與成骨細胞共同培養于鈦基表面，發現各組細胞中的促炎因子白細胞介素1β和腫瘤壞死因子α的釋放量都保持在正常水平，說明沒有發生嚴重炎癥反應，可以提高鈦基骨植入物整合的有效性。Zhang等[36]用甲基丙烯酸作為橋梁，將絲膠蛋白接枝于鈦基骨表面，提高了其成骨細胞的黏附和增殖，同時賦予了鈦基骨表面一定的抗菌性能。

4?結論與展望

組織工程在過去幾十年的時間內已經成為了壞損組織和器官修復極具潛力的手段，骨/軟骨組織工程研究熱點已經從需要二次手術更換的不可降解支架，轉變為可調控細胞行為、促進細胞增殖和組織再生且無需取出的可降解生物活性支架。許多研究證明，絲膠蛋白是一種生物活性大分子，生物相容性好、免疫原性低等。絲膠蛋白基骨/軟骨組織工程支架與人體組織結合良好并能誘導礦化和干細胞分化，在骨/軟骨組織修復和再生方面將發揮不可估量的作用。但目前絲膠蛋白基的骨/軟骨組織工程支架，無論是水凝膠還是多孔材料，主要挑戰是機械性能的不足，不能滿足骨/軟骨組織暫時的力學替代要求。另外，制備過程中的一些不溶化手段可能會對細胞或肌體產生理化不良作用，尤其是水凝膠，這是組織工程支架研制與應用過程中需考慮的重要問題，需要通過長期體內試驗才能驗證。相信隨著材料和化學科學的發展，將會出現更多生物安全性更高的絲膠蛋白及其復合材料的骨/軟骨組織工程支架的構建策略，不僅能解決日益增多的骨/軟骨組織壞死或缺損的臨床需要，也將為減少絲綢工業的絲膠蛋白排放污染做出重大貢獻。

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