外泌體在骨骼肌損傷修復中的研究進展

周 敏 李秉樞 劉 成 洪莎莎 胡 鳴 閔 潔 湯劍明 洪 莉

武漢大學人民醫院婦產科，湖北武漢 430060

骨骼肌損傷是一種常見的臨床損傷性疾病，通常是由外力直接作用導致骨骼肌纖維挫傷和撕裂或間接作用牽拉損傷肌纖維所致。骨骼肌損傷后修復不良可造成機體肌肉功能障礙，嚴重影響患者的日常生活。目前，關于骨骼肌損傷性疾病的治療方法均存在明顯的問題，因此迫切需要探索更有效的新型療法[1]。外泌體是一類由細胞分泌的納米級胞外囊泡，因其在不同生理狀態下差異性攜帶內容物，近年來在疾病診斷與治療領域的應用備受關注。研究表明，外泌體參與骨骼肌纖維的正常生長發育和損傷后再生過程，可作為骨骼肌損傷性疾病的一種新型療法，不僅能取得較好的治療效果，還可以避免并發癥[2-3]。本文總結了外泌體在骨骼肌損傷修復領域的國內外最新研究成果，從外泌體的生物學特性、功能及在骨骼肌損傷性疾病中的應用進行綜述。

1 外泌體生物學特性及功能

外泌體是一種粒徑在30～150 nm 之間的脂質雙層膜胞外囊泡，存在于多種哺乳動物細胞及體液[4]。外泌體內富含核酸、蛋白質、脂質及氨基酸和代謝產物。2007 年Valadi 等[5]首次發現外泌體內含有生物活性的信使RNA（mRNA）和微小RNA（miRNA/miR），將小鼠來源的外泌體與人細胞系共培養，結果在人細胞系中檢測到一些小鼠蛋白，而這些蛋白在小鼠外泌體中僅以mRNA 的形式存在，表明mRNA 通過外泌體轉移到受體細胞且被翻譯成蛋白質[6]。因此，外泌體被認為是一種新型的分子水平轉移媒介，可以將其載荷的內容物運輸到靶細胞且影響受體細胞的功能，在細胞間“通訊”中發揮重要作用。

外泌體具有非常重要的臨床應用價值。首先，外泌體可作為一種新型的疾病預測及診斷手段。隨著生理狀況的變化，外泌體分泌量及其內容物會顯著不同，根據其內特定的蛋白或miRNA 可預測、診斷及預后疾病[7]。研究者已證實通過檢測血清外泌體miR-1246 水平可診斷侵襲性前列腺癌及預測該病情的進展[8]。其次，外泌體可作為藥物的運輸載體。由于外泌體的磷脂雙層膜結構，其可以通過藥物難以逾越的生物屏障，同時避免局部炎癥和免疫排斥反應，將外泌體作為藥物運輸載體，既能實現臨床疾病的靶向治療，又可以延長藥物的半衰期。目前，外泌體通過遞送化學藥物在癌癥、炎癥和神經系統疾病治療領域的作用得到有效證實[9]。外泌體還可以通過攜帶特定RNA分子在基因水平治療疾病。Tao 等[10]通過外泌體使沉默RNA 結合到腫瘤細胞，引起目標mRNA 沉默，抑制消化系統腫瘤的生長。由此，外泌體在臨床治療領域具有廣闊的應用前景。

2 骨骼肌損傷修復的反應過程

骨骼肌損傷后的修復過程可分為兩個階段，即炎癥反應與修復重建階段。骨骼肌損傷初始為炎癥反應階段，一般是傷后第1～2 天，肌纖維變性、壞死和周圍血管廣泛破壞，促炎癥反應調節物質包括炎癥因子和趨化因子釋放，促使外周循環中的中性粒細胞經血管內皮游出血管壁滲入受損區域，中性粒細胞進一步釋放促炎癥因子擴大炎癥反應，同時募集促炎型巨噬細胞、調節性T 細胞等其他骨髓細胞浸潤到損傷部位發揮吞噬作用清除受損肌纖維等壞死組織碎片，此外，成纖維細胞、成纖維脂肪祖細胞等細胞也參與初始炎癥反應的清除過程[11-12]。炎癥反應后為修復階段，一般是傷后第3～6 天，免疫細胞分泌大量的細胞因子及大分子蛋白如生長因子、細胞外基質（extracellular matrix，ECM）和ECM 重塑基質金屬蛋白酶等，激活靜息狀態的衛星細胞（statellite cell，SCs），產生ECM 趨化片段，同時促炎型巨噬細胞轉為抗炎型巨噬細胞，參與調控SCs 與成肌細胞增殖與分化[13-14]。SCs 激活、増殖和分化形成新的肌管，然后與存活肌纖維融合，修復損傷肌纖維，同時產生新的ECM 包括肌內膜、肌束膜和肌外膜[15]。若骨骼肌損傷嚴重且范圍過大，損傷處可見結締組織瘢痕形成和毛細血管再建，一般在損傷后第14 天，肌肉新生完成，再生骨骼肌成熟，ECM 經歷重塑，瘢痕組織機化，骨骼肌損傷修復與再生完成[16]。

3 外泌體與骨骼肌損傷修復

骨骼肌的損傷修復中肌衛星細胞的激活和肌源性分化是決定肌肉再生的最重要階段，此外細胞之間的相互作用同樣對骨骼肌纖維的再生至關重要。研究表明，在小鼠急性肌肉損傷模型中，肌纖維損傷后的最初幾小時以及損傷后的第5～7 天再生過程中循環外泌體均顯著增加，并且證實外泌體主要由損傷的肌纖維和肌肉再生相關的其他細胞產生[17]。因此，不同來源的外泌體在肌肉損傷修復中不同階段可能發揮著不可忽視的作用。目前，研究者對外泌體在骨骼肌損傷修復中的研究重點集中在其攜帶的內容物，因此主要從以下3 個方面進行闡述。

3.1 外泌體蛋白介導的骨骼肌損傷修復

骨骼肌損傷早期，肌膜破損后胞內發生一系列急性反應進行肌動蛋白重組和膜重塑以數分鐘內輔助肌膜愈合，其中鈣依賴性磷脂結合蛋白A1 是肌膜損傷修復的關鍵蛋白[18]。Bizzarro 等[19]證實外泌體內富含的鈣依賴性磷脂結合蛋白A1 通過作用甲酰基肽受體刺激成肌細胞增殖從而修復骨骼肌質膜以促進肌肉損傷修復。除了對肌膜修復作用外，外泌體蛋白還在肌纖維損傷后的炎癥與抗炎過程中發揮作用。炎癥過程中伴隨炎癥因子釋放增多，肌管富含肌生成抑制蛋白的外泌體分泌增加，外泌體通過攜載的肌生成抑制蛋白抑制生肌決定因子和肌細胞生成素表達以及蛋白激酶B 和雷帕霉素靶蛋白介導的肌生成信號通路，同時增加成肌細胞環氧化酶2 的表達[20]。因此，在肌肉修復的早期炎癥反應階段，外泌體通過其內蛋白限制肌生成并促進炎癥細胞清除受損組織。此外，再生抗炎階段，損傷的肌纖維還可以自分泌外泌體進行修復。Forterre 等[21]發現，成肌細胞和肌管在肌肉分化過程中能夠分泌外泌體，且肌管釋放的外泌體中富含絲蛋白和肌聯蛋白等多種蛋白，隨后體外實驗研究表明氧化損傷的肌管會釋放外泌體，并通過其蛋白抑制靶衛星細胞中的肌細胞生成素表達，從而促進衛星細胞和成肌細胞增殖，加速損傷愈合[22]。Guescini 等[23]也證實，骨骼肌撕裂傷后自分泌富含肌原性生長因子的外泌體，誘導間充質干細胞向肌原性譜系分化以促進肌肉損傷修復。

3.2 外泌體miRNA 介導的骨骼肌損傷修復

miRNA 在骨骼肌損傷修復中的作用已得到廣泛研究，由于外泌體攜帶豐富的miRNAs，越來越多的研究揭示了各種細胞來源的外泌體miRNAs 參與骨骼肌的再生修復。間充質干細胞源性外泌體內富集miR-125b、miR-494 和miR-601，研究發現，這些miRNAs 可作用于肌衛星細胞和成肌細胞，刺激其內生肌決定因子和肌細胞生成素的表達增加，調控其增殖和分化，同時還可以減弱肌纖維化，提高毛細血管密度，加速損傷肌肉的再生[24-25]。SCs 源性外泌體可轉移其載荷的miR-1 至鄰近的SCs，通過改變其成肌相關基因的表達促進SC 分化[14]。SCs 源性外泌體還可以通過激活成纖維細胞、沉積和降解ECM 以及補充組織細胞來重塑受損組織。超負荷誘導的肌肉損傷模型中SCs 源性外泌體通過轉移其攜帶的miR-206 抑制鄰近的成纖維細胞核糖體結合蛋白-1 表達，從而抑制膠原蛋白和纖連蛋白的生成，輔助受損肌肉再生和重塑[26]。成熟肌管以及成肌細胞源性外泌體中同樣包含有多種與肌肉分化密切相關的miRNAs，如miR-133a和miR-133b，分別通過負調控成肌細胞中的Foxl2基因以及肌衛星細胞Pax7 基因的表達促進肌纖維再生[27-28]。骨骼肌去神經損傷后，肌肉衍生的外泌體從miR-720 轉變為miR-206 富集狀態，進而促進骨骼肌損傷修復[29]。此外，高強度騎車運動誘發的肌肉損傷中，肌肉衍生的外泌體miR-208a 參與調節肌纖維類型[30]。上述研究表明，在骨骼肌損傷疾病中，不同來源外泌體特定的miRNAs 在損傷背景下選擇性裝載和釋放，參與肌纖維的再生和重塑。

3.3 外泌體其他內容物介導的骨骼肌損傷修復

外泌體內除miRNA 和蛋白之外還含有其他信息物質。Yan 等[31]發現間充質干細胞來源的外泌體可以改善小鼠缺血性肌肉損傷后的血液灌注和肌力及延長小鼠跑步距離，還能夠抑制局部缺血所致的炎癥小體引起細胞焦亡，進一步研究發現外泌體是通過其內環狀RNA-circHIPK3 靶向肌細胞miR-421/FOXO3a，從而抑制細胞焦亡和白細胞介素-1 等炎癥因子升高來修復骨骼肌缺血性損傷。Guescini 等[32]發現，體外培養的小鼠成肌細胞可以釋放外泌體且其內攜帶線粒體DNA，并推測線粒體DNA 可通過外泌體途徑進入靶細胞線粒體，向靶細胞傳遞信號進行調控，隨后的研究也證實了猜想，高脂飲食喂養的小鼠的骨骼肌釋放的外泌體能夠誘導成肌細胞增殖并調節成肌細胞周期和分化相關基因的表達。此外，脂質組學分析也表明外泌體攜帶的脂質可在肌肉細胞之間轉移，外泌體可以作為“類旁分泌”信號來調節肌肉動態平衡。

3 小結

外泌體是一種直徑在30～150 nm 并攜帶多種信息物質的細胞外囊泡，其在骨骼肌損傷和修復過程中選擇性裝載內容物，因此探究骨骼肌損傷修復過程中外泌體的不同內容物，可以針對疾病發生的不同時間段進行優化治療，大幅度改善患者的骨骼肌損傷情況。盡管外泌體在骨骼肌損傷性疾病臨床治療方面具有良好的應用前景，但是不同來源外泌體內復雜的信息物質類別、轉運機制及作用機制等問題仍未明確，且對于外泌體量化生產及儲存問題還面臨一定的挑戰，這些問題還需要進一步探討。