石斛提取物與糖尿病視網膜病變相關研究進展

俞越，李春霞，史春

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的微血管并發癥，是導致全球工作年齡人群視力障礙和失明的主要原因之一，大約1/3的糖尿病患者發生視力損害。目前，用于治療DR 的主要有效方法包括視網膜激光光凝術、玻璃體切割術、皮質類固醇或抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）治療，這些方法雖有效果，但不能完全消除疾病的進展或逆轉視網膜損傷[1-4]。中藥是用于預防、治療、診斷疾病并具有康復與保健作用的物質。其中石斛是我國的名貴藥材，始載于 《神農本草經》[5]：“主傷中，除痹，下氣，補五臟虛勞，羸瘦，強陰，久服厚腸胃，輕身延年”。在2015 年版《中華人民共和國藥典》[6]中收錄了4 種石斛，分別為鐵皮石斛、金釵石斛、鼓槌石斛和流蘇石斛，其具有多種化學成分。近年來，國內外研究[6-9]發現，降血糖、抗血管生成、抗炎、抗氧化應激等是石斛主要的藥理活性。本文就石斛總提取物及石斛酚、石斛多糖、毛蘭素、石斛堿對DR 的作用及機制進行論述。

1 石斛的化學成分及主要特征

石斛的主要化學成分為聯芐類、多糖類、菲類、生物堿類和香豆素類等[9]。多糖類是石斛的主要成分之一，抗氧化及降血糖是石斛多糖的主要作用。廖瀅等[10]發現，酸性多糖抗氧化活性與糖醛酸官能團含量正相關，與硫酸糖含量負相關。

石斛堿是金釵石斛的特征性成分，具有顯著的生物活性，常作為金釵石斛定性定量的重要指標。《中華人民共和國藥典》[6]規定金釵石斛的石斛堿含量不得低于0.4%。汪代芳等[11]從金釵石斛中分離出11 種化合物，其中包括2 個石斛素型生物堿：石斛堿、石斛醚堿；5 個有機胺類生物堿：N-反式桂皮酸酰對羥基苯乙胺，N-反式阿魏酸酰對羥基苯乙胺，N-順式阿魏酸酰對羥基苯乙胺，N-反式香豆酰酪胺，N-順式香豆酰酪胺。

聯芐類與菲類具有良好的體外抗血管生成及清除自由基的作用。目前已從7 種石斛中提取到9 種具有菲核的化合物，從5 種石斛中提取到8 種具有9、10-雙氫菲母核的化合物，從4 種石斛中提取到5 種具有菲醌母核的化合物；從14 種石斛中提取出15 種具有聯芐類母核的化合物。其中石斛酚、毛蘭素、杓唇石斛素、鼓槌聯芐及鼓槌石斛素均屬于石斛中的聯芐類化合物，石斛酚的含量為0.0004%～0.391%；杓唇石斛素的含量為0.001%～0.244%；毛蘭素的含量為0.001%～1.68%；鼓槌聯芐的含量為0.001%～0.044%；鼓槌石斛素的含量為0.001%～0.027%[12]。

香豆素類具有良好的擴張血管、抗凝血等功能，其主要包括香豆素（coumarin）、東莨菪內酯（scopoletin）、濱蒿內酯（scoparone）和澤蘭內酯（ayapin）。通過鑒定發現香豆素的含量為0.0050%～0.0623%；東莨菪內酯的含量為0.0038%～0.0164%；濱蒿內酯為0.0087%～0.34%；澤蘭內酯為0.005%～0.197%[12]。

2 石斛提取物與DR 的相關研究

2.1 石斛總提取物與DR

石斛自古以來就是治療消渴的專藥。目前研究發現，石斛總提取物在DR 的動物模型中有治療作用。石斛總提取物可以抑制人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）上VEGF 誘導的毛細血管生成，還可以通過上調胰島素的分泌、促進肝糖原的合成、降低胰高血糖素分泌的方式起到抗糖尿病的作用[13]。宓文佳等[14]研究了石斛根提取物對糖尿病鼠的降糖作用。運用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）造模的糖尿病大鼠在使用鐵皮石斛根提取物后，血糖、糖化血紅蛋白、血清胰島素等檢測指標均下降，表明鐵皮石斛根提取物可以降低2 型糖尿病模型小鼠的空腹血糖，并能有效改善小鼠的毛色、體溫、活動量，生活質量和口服糖耐量。高瑋等[15]研究了鼓槌石斛乙醇提取物對糖尿病大鼠視網膜凋亡相關因子表達的影響。病理結果顯示，鼓槌石斛乙醇提取物干預后的糖尿病大鼠視網膜內、外核層界限較糖尿病組清晰，神經節細胞層腫脹減輕；免疫組化結果顯示，藥物干預組的大鼠只在視網膜神經節細胞層、色素上皮層存在Caspase-3 陽性表達，且呈劑量依賴性遞減。這些結果提示，鼓槌石斛乙醇提取物可能通過抑制細胞凋亡對糖尿病大鼠的視網膜組織病變起到保護作用。Lee 等[16]研究了鼓槌石斛乙醇提取物對DR 的效果及其機制。視網膜熒光染色結果顯示，鼓槌石斛乙醇提取物可降低STZ 誘導的糖尿病大鼠視網膜血管的異常增殖；q-PCR 結果表明，它可以降低VEGF、VEGFR-2 mRNA 的表達以及血清中VEGF 的水平；糖尿病組在治療后，視網膜MMP2/9、血清MMP2/9、血小板衍生生長因子A/B、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、p65 磷酸化和ICAM-1 的水平被抑制。這些發現表明，鼓槌石斛乙醇提取物對炎性因子和糖尿病大鼠視網膜內緊密連接蛋白有抑制作用。

2.2 石斛酚與DR

石斛酚是從石斛中提取出的一種聯芐類化合物，常被作為衡量石斛藥材質量的質控指標[17]。醛糖還原酶（aldose reductase，AR）是DR 發病機制中多元醇通路的關鍵限速酶，AR 的增加會促使1 型糖尿病患者對視網膜病變的易感性增加[18]。魏小勇等[19]研究發現，石斛酚對AR 的活性有抑制作用。張梅等[8]研究了石斛酚對高糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞（HRMECs，ACBRI181）中AR 通路和氧化應激的作用機制。熒光探針DCFH-DA 活性氧檢測結果顯示，各石斛酚組的HRMECs 中活性氧（reactive oxygen species，ROS）表達均低于高糖組；qRT-PCR 結果顯示，石斛酚組的缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）/VEGF 表達低于高糖組；Western blotting 結果顯示，石斛酚各組核轉錄因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）蛋白表達低于高糖組。這些結果提示，石斛酚能抑制HRMECs 中AR 通路和氧化應激反應的表達，并能抑制VEGF 的表達。

在DR 早期血-視網膜屏障通透性增強，因此，保護血管內皮細胞對于其治療具有重要意義。徐萬里等[20]研究了石斛酚對高糖損傷的人臍靜脈的永生化內皮細胞（EA.hy926）的保護作用及其機制。在細胞抗氧化實驗中發現，在高糖+2.5 μM 石斛酚組中的細胞超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）低于高糖組，且脂質過氧化物丙二醛含量較高糖組增加；細胞活性檢測顯示，使用2.5 μM 的石斛酚干預后細胞凋亡率低于高糖組。這些結果提示，石斛酚能抑制半胱天冬酶-3 活性，降低細胞凋亡率，提高細胞活力。此外，石斛酚還可以降低高糖對內皮細胞的損傷程度，有助于維護血管的結構和功能完整。

2.3 石斛多糖與DR

降血糖是石斛多糖的主要生物學作用之一，石斛中含有較多的多糖類成分，粘稠高，總多糖含量最高在30%～45%之間[21-22]。Müller 細胞是一種特化的神經膠質細胞，具有維持視網膜正常結構的功能，在DR 進展中可能起著重要作用。李雅嘉等[23]研究了鐵皮石斛多糖保護糖尿病引起的視網膜損傷的作用機制。MTT 實驗結果顯示，鐵皮石斛多糖組的Müller 細胞活力高于高糖組，且呈濃度依賴性增加；細胞凋亡實驗顯示，石斛多糖組中的Müller 細胞凋亡低于高糖組，且呈濃度依賴性減少。上述結果提示，鐵皮石斛多糖可能通過提高Müller 細胞活性，減少Müller 細胞的凋亡，達到保護Müller細胞的作用。

炎癥是DR 的重要發病機制之一，在DR 早期發揮了重要作用。李靜文等[24]采用STZ 誘導的SD 大鼠糖尿病模型，探討石斛多糖在早期DR 中的抗炎作用和機制。研究發現，石斛多糖組中IL-6，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），VEGF 蛋白表達較糖尿病組下降，認為抗炎作用機制可能與其抑制NF-κB 表達有關。這些結果提示，石斛多糖可降低糖尿病大鼠視網膜中炎性因子及VEGF 的表達。

張貝貝等[25]研究了石斛多糖對糖尿病引起的血管內皮細胞損害的作用機制。首先運用qRT-PCR 檢測發現，鐵皮石斛組中Bax mRNA 的表達低于高糖組，且隨著鐵皮石斛活性成分濃度的增加，抑制作用增強；隨后運用MTT 法檢測HUVEC細胞活性發現，鐵皮石斛多糖組的細胞生長優于高糖組，細胞凋亡低于多糖組。通過上述研究發現，鐵皮石斛多糖可能從基因水平抑制高糖誘導的HUVEC 中Bax mRNA 表達，增強Bcl-2mRNA 表達，抑制血管內皮細胞凋亡，從而達到防治DR 的目的。

2.4 毛蘭素與DR

毛蘭素是普遍存在于石斛中的一種低分子量的天然產物，其抗氧化和抗血管增生作用是其公認的重要藥理作用。鼓槌石斛中分離得到的5 種化合物，分別鑒定為毛蘭素、β-谷甾醇、鼓槌菲、毛蘭菲和鼓槌聯芐，其中毛蘭素含量最高[26]。同時我國藥典[7]中已確定了毛蘭素作為鑒別鼓槌石斛的主要成分。DR 分為2 個階段：非增殖性糖尿病視網膜病變（non-proliferative diabetic retinopathy，NPDR）和增殖性糖尿病視網膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）。其中PDR的標志性特征便在于視網膜或視盤表面上異常增殖的新生血管。VEGF 是一種有效的內皮細胞有絲分裂原。其作用通過刺激增殖，遷移和管腔的形成，促進新生血管的生成[27-28]。高瑋[29]研究了鼓槌石斛的活性成分毛蘭素對高糖誘導的恒河猴脈絡膜視網膜內皮細胞（RF/6A）的作用機制。結果顯示，毛蘭素組中PERK-eIF2α-CHOP 信號通路的表達低于高糖組；在使用毛蘭素干預后RF/6A 細胞中炎性因子IL-1、IL-6 及TNF-α 水平的表達較高糖組降低，且VEGF 信號通路的基因表達低于高糖組。Yu 等[30]探討了毛蘭素對視網膜新生血管形成的抑制機制及其對DR 改善的作用。在體外實驗研究中發現，毛蘭素可以抑制高糖誘導的RF/6A 細胞中的血管形成，且效果優于貝伐單抗，此外，毛蘭素可以抑制RF/6A 細胞中的高糖誘導的HIF-1α 介導的VEGF 表達；在體內實驗中還發現，毛蘭素可以消除STZ 誘導的高血糖小鼠視網膜中的新生血管。上述實驗結果表明，毛蘭素通過阻斷視網膜內皮細胞和小神經膠質細胞中ERK1/2 介導的HIF-1α 活化來消除高糖誘導的VEGF 表達，并進一步抑制VEGF 誘導的VEGFR2 及其下游信號的激活，從而抑制視網膜新血管生成。Zhang T 等[31]研究鼓槌石斛提取物毛蘭素對于DR 進展中的保護作用發現，毛蘭素可以減輕血-視網膜屏障的分解，減少小膠質細胞活化，ERK1/2 磷酸化，NF-κB 轉錄激活和TNF-α表達升高。上述結果提示，毛蘭素可能通過ERK1/2-NF-κB信號通路抑制高血糖介導的小神經膠質細胞的活化減少視網膜炎癥來減輕DR。

2.5 石斛堿與DR

生物堿類成分是最早從石斛屬植物中分離得到的化合物，也是最早受到關注和研究的化學成分。鈴木秀干等首次從金釵石斛中獲得生物堿，命名為石斛堿[21]。通過現代藥理學研究[6]發現，降血糖是金釵石斛的主要藥理作用之一，其小分子的化學成分以石斛堿等生物堿為主，但尚未有研究證明石斛堿與DR 之間的相關性。

3 小結

綜上所述，石斛提取物對DR 的發病機制具有抑制作用，針對石斛中具體組分的研究主要從石斛酚、石斛多糖、毛蘭素等的抗VEGF、抗炎、抗氧化等通路展開。石斛生物堿作為金釵石斛中最重要的成分之一，對于其治療DR 的作用機制尚不可知。此外，膠質、神經和微血管功能障礙也是引發DR的重要機制[32]，石斛提取物對于這些機制的效應也值得進一步關注。