基于高通量測序方法研究腌制麻竹筍發酵過程中細菌群落的動態演替

李薇，吳良如，索化夷，張甫生，鄭炯*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(國家林業局竹子研究開發中心，浙江 杭州，310012)

麻竹筍(Dendrocalamuslatiflorus)是禾本科竹亞科植物的新生芽，富含膳食纖維、氨基酸，蛋白質以及竹多糖、抗壞血酸和多酚等功能性物質，具有抗氧化、清除血清膽固醇及預防心血管疾病等生理活性功能[1]。鮮筍的采收季節性及貯藏過程中易失水和木質化等特點限制了麻竹筍加工產業的發展，而采后加工有利于解決這一產業瓶頸。腌制麻竹筍加工易，成本低，易于保存，是常用的竹筍加工方法之一[2]。腌制過程伴隨著由微生物主導的系列生物化學反應，最終形成獨特的風味和較高的營養價值。因此，了解麻竹筍腌制過程中的微生態結構及動態變化對于其風味特征的形成機制研究具有重要作用。

早期微生物多樣性研究主要采用傳統的分離培養技術，然而絕大多數微生物無法被分離，受到較大限制[3]；而后出現的DNA指紋圖譜、BIOLOG、基因芯片等技術能夠直接對環境中的微生物群落進行分析，但僅能靶標優勢類群，無法真實反映微生物的區系變化規律[4]。高通量測序技術采用邊合成邊測序的方法，能同時對幾百萬條DNA分子進行測序，不僅耗時短、效率高，還具有較高的安全性和準確性，極大地推進了微生物組學研究[5]。目前高通量測序技術已在腌制發酵蔬菜的微生物多樣性研究中得到廣泛應用。YU等[6]采用高通量測序技術從四川省6個地區采集的泡菜中分離出185株乳酸菌，準確鑒定出81株植物乳桿菌、38株戊糖乳桿菌和24株短乳桿菌；TANG等[7]應用高通量測序方法比較了重慶和四川兩地區腌制蘿卜中的優勢菌群差異；LIU等[8]利用高通量測序技術對10種發酵蔬菜的細菌群落多樣性進行了研究，證明了產地、原料種類以及發酵環境對細菌多樣性具有較大影響。

加鹽腌制是發酵蔬菜的必要環節，而食鹽濃度對腌制麻竹筍中總酸、水分、亞硝酸鹽、VC、總黃酮、Ca2+、Mg2+、果膠含量以及細菌菌落總數等均有較大影響，因此對腌制麻竹筍的品質、風味的形成以及微生物群落的組成具有至關重要的作用[9-10]。本課題組前期采用聚合酶鏈式反應-變形梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)技術分析了不同鹽濃度腌制麻竹筍中的主要優勢菌群[11-12]，但目前還未見系統對比不同鹽濃度下麻竹筍中菌群動態變化規律的報道。因此，本研究擬采用高通量測序技術探究不同鹽濃度腌制條件下麻竹筍中菌落的動態演替，進一步揭示鹽濃度對微生物多樣性的影響，從而為探尋微生物群落與腌制麻竹筍的品質間的關系奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻竹筍,購于重慶市北碚區農貿市場；瓊脂糖凝膠，西班牙biowest公司；聚合酶Fast Pfu Polymerase，北京TransGen公司；DNA純化試劑盒、AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒，美國Axygen公司；土壤基因組提取試劑盒，Omega公司。

1.2 儀器與設備

YX280A手提式不銹鋼滅菌鍋，上海三申醫療器械有限公司；Eppendorf 5430R小型離心機、Eppendorf 5424R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠；BioTek ELx800酶標儀，美國Biotek公司；TBS380微型熒光計，美國TurnerBioSystems公司；Covaris M220超聲波破碎儀，基因有限公司；QL-901渦旋混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺，蘇凈凈化設備有限公司；S1000 Thermal CyclerPCR 擴增儀，美國Biorad 公司；NanoDrop2000超微量分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific 有限公司。

1.3 樣品制備

將新鮮竹筍剝殼，切成片狀。然后沸水漂燙10 min、瀝干后將2 kg竹筍裝入泡菜壇，分別向壇中添加5 g/100mL和15 g/100mL的食鹽水，料水比為1∶1(g∶mL)，將壇子密封后在室溫(20～25 ℃)下進行自然發酵。分別在1、3、5、7、10、14、21、28、35、42 d收集發酵液樣品(5 g/100mL鹽質量濃度組編號為A1、A3、A5、A7、A10、A14、A21、A28、A35、A42；15 g/100mL 鹽質量濃度組編號為B1、B3、B5、B7、B10、B14、B21、B28、B35、B42)，并將樣品在 DNA提取之前儲存在-80 ℃至最后一次取樣完成后統一進行DNA提取。

1.4 宏基因組DNA提取及PCR擴增

根據Omega土壤基因組提取試劑盒說明書進行總DNA抽提，對DNA濃度和純度進行檢測后，利用1%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。以338F-806R作為引物對細菌16S rRNA V3～V4區序列進行擴增，用2%的瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用DNA純化試劑盒進行純化，用Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。使用微型熒光計對PCR進行檢測定量。將處理好的PCR擴增產物送到上海美吉生物醫藥科技有限公司采用Illumina Miseq進行測序。

1.5 數據與圖譜分析

高通量測序數據用美吉云計算平臺進行分析。使用UPARSE軟件，根據97%的相似度對序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP(Ribosmal Database Project) classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數據庫(SSU123)，設置比對閾值為70%。使用RDP細菌16S rRNA數據庫注釋OTUs序列。

2 結果與分析

2.1 腌制麻竹筍細菌OTU分布

OTU與物種呈現對應關系，可通過分析OTU分布情況了解樣本中微生物的多樣性與存在量[13]。基于 16S rRNA 基因測序所獲得的細菌群落OTU維恩圖如圖1所示，共得到2 417個OTU。不同鹽濃度樣本中OTU分布具有較大差異。部分OTU是兩種鹽濃度樣本所共有的(575例，23.79%)，高鹽質量濃度(15 g/100mL)樣本獨有的OTU數目為286例(11.83%)，總共持有的OTU數目為861例，而低鹽質量濃度(5 g/100mL)樣本中則有1 556例(64.38%)特異性檢測，總共持有2 131例OTU，均顯著高于低鹽濃度樣本。

2.2 腌制麻竹筍細菌α多樣性

Chao指數反映群落豐富度，Shannon指數反映群落多樣性[14]。由圖2-a可知，發酵前28 d不同鹽濃度樣本Chao指數變化趨勢均不明顯，集中在250左右，并且均在發酵第10天達到最低值，第35天達到最高值。具體來看，5 g/100mL鹽質量濃度腌制麻竹筍在第35天Chao指數急速上升至1 372.89，發酵42 d時略有下降(1 252.29)；15 g/100mL鹽質量濃度樣本在第35天達到582.46，后又降低至較低水平(171.78)。說明發酵前、中期(28 d及以前)鹽濃度對腌制麻竹筍細菌群落豐富度(OTU數目)影響較小，而高鹽濃度抑制了腌制后期(28～35 d)群落豐富度的增長，使得成品竹筍(42 d)群落豐富度較低。群落多樣性是群落豐富度及群落均勻度的綜合指標[5]。圖2-b顯示，低鹽濃度樣本細菌群落多樣性波動范圍更大，尤其是發酵第7、21、28天，在群落豐富度差異不大的情況下，5 g/100mL鹽質量濃度的Shannon指數顯著高于15 g/100mL鹽質量濃度，說明低鹽濃度使得樣本中細菌群落均勻度更高。15 g/100mL鹽質量濃度Shannon指數維持在較為穩定的水平，說明高鹽濃度減緩了麻竹筍腌制過程中細菌群落的演替。

a-Chao指數；b-Shannon指數圖2 不同鹽濃度腌制麻竹筍細菌群落α多樣性分析Fig.2 α diversity analysis of the bacterial in pickled Ma bamboo shoots with different salt concentration

2.3 腌制麻竹筍細菌群落結構分析

細菌在門水平上的高通量相對豐度分布如圖3-a所示。經分類學注釋發現，厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門 (Proteobacteria) 和藍藻細菌門(Cyanobacteria)在2種鹽濃度腌制麻竹筍中均是優勢菌門(平均相對豐度>1%)，并且同一菌門在兩類樣本中平均相對豐度較為接近，但分布上有較大差異：低鹽濃度下Firmicutes在腌制第3天就占據了98.03%的絕對優勢地位，卻在腌制第35天降低到22.20%；而高鹽濃度下Firmicutes在腌制第7天才達到94.46%，但此后相對豐度一直維持在90%左右；Proteobacteria相對豐度較高的時期分別集中在低鹽濃度腌制中、后期(21～42 d)和高鹽濃度腌制前期(1～5 d)；Cyanobacteria在低鹽濃度腌制第1天相對豐度達到54.19%，隨著腌制發酵的進行(3～14 d)相對豐度陡然降低至1%以下，在第35天重新提升至14.80%，高鹽濃度下Cyanobacteria呈現先降低后趨于穩定的趨勢，在整個發酵過程中相對豐度均>1%。擬桿菌門(Bacteroidetes)從第28天迅速上升，在成品竹筍中達到20.05%，成為低鹽度樣本中的優勢菌屬。2個鹽度樣本在腌制35 d時群落結構最豐富，檢測到的9種主要菌門均同時出現，但明顯除Firmicutes外，其余菌門在低鹽樣本中的相對豐度均高于高鹽樣本。

從屬水平來看(圖3-b)，細菌在2種鹽濃度樣本中的群落結構分布有較大差異。乳酸桿菌屬(Lactobacillus)在低鹽及高鹽樣本中的平均相對豐度分別為35.39%及54.48%，是絕對優勢菌屬，在低鹽腌制中呈現逐步增加后迅速降低趨勢，在高鹽度下呈現迅速增加，并在腌制5～42 d維持在65%左右的水平。5 g/100mL鹽質量濃度樣本中，乳球菌屬(Lactococcus)及魏斯氏菌屬(Weissella)的平均相對豐度分別為15.62%和6.79%，屬于優勢菌屬，但兩者均隨發酵進行相對豐度逐漸降低，而在高鹽樣本中兩者的平均相對豐度還不到0.1%；藍藻細菌屬(Cyanobacteria_norank)、鹽單胞菌屬(Halomonas)和氣球菌屬(Aerococcus)的平均相對豐度分別為6.82%、3.86%和2.02%，它們僅集中出現在腌制的某一個時期(分別為第1、21、28天)，演替較快。反觀15 g/100mL鹽質量濃度樣本，各主要菌屬的更迭速度平緩，其中包括海細菌屬(Marinobacterium)，平均相對豐度為7.14%，活躍在腌制前5 d，此后降低至較低水平；Cyanobacteria_norank(10.95%)，發酵前3 d相對豐度>30%，并且在整個發酵過程中相對豐度都>1%；Aerococcus(17.62%)從發酵第5天開始相對豐度迅速增加，此后在整個腌制過程中均占據主導地位。腌制第35天2個鹽濃度樣本菌落多樣性迅速增加，預示著發酵進入尾聲，其中低鹽濃度樣本的多樣性顯著高于高鹽濃度樣本，并且在前期占主導作用的Lactobacillus、Halomonas、Aerococcus等菌屬的優勢地位被多種新增的相對豐度較小的菌屬取代，菌屬分布更加均衡，而高鹽濃度樣本中發揮主導作用的優勢菌屬并未發生較大變化，與α多樣性結果一致。

a-門水平；b-屬水平圖3 不同鹽濃度腌制麻竹筍中細菌在門水平 和屬水平的高通量相對豐度Fig.3 High flux relative abundance of the bacterial at phylum level (a) and genus level (b) in pickled Ma bamboo shoots with different salt concentration注：others為平均相對<1%的門或屬

2.4 腌制麻竹筍細菌聚類分析及主成分分析

采用非加權組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)構建樹狀結構進行層聚類分析，樹枝的長短可直觀呈現不同鹽濃度下麻竹筍腌制過程中群落組成的相似或差異程度。如圖4-a所示，15 g/100mL鹽質量濃度樣本細菌群落結構的遺傳距離較短，而5 g/100mL鹽質量濃度下細菌群落結構遺傳距離較大，尤其是腌制后期與其他時期間存在較大差距，說明高鹽濃度下細菌群落結構演替較為緩慢，相鄰階段細菌群落組成的相似度較高，而低鹽濃度下細菌演替激烈，尤其是腌制后期(28～42 d)細菌群落組成發生較大變化。由細菌群落結構主成分分析圖(圖4-b)可知，PC1軸(53.07%)能夠很好地區分15 g/100mL鹽質量濃度樣本腌制過程中的細菌群落，而5 g/100mL鹽質量濃度下的細菌群落結構則更易被PC2軸(18.34%)所區分。2種鹽濃度樣本點整體距離較遠，其中5 g/100mL鹽質量濃度樣本點集中在一、四象限，15 g/100mL鹽濃度樣本點集中在二、三象限，說明2種鹽濃度腌制條件下細菌群落結構組成差異較大。腌制前期樣本點A1、B1和B3分布較為集中，與其他樣本點隔離開來，結合群落結構分析結果來看，低鹽濃度下細菌區系在腌制第3天發生較大變化，而高鹽濃度下細菌區系在第5天產生較大改變，2種鹽濃度下發酵第1天的菌群構成相似，均以Cyanobacteria_norank、Marinobacterium、希瓦氏菌屬(Shewanella)為優勢菌屬。另一個聚集點出現在腌制第21天，其主要原因是Aerococcus菌屬在A21突然涌現，導致A21與B21中細菌群落結構相似。

a-聚類分析；b-主成分分析圖4 不同鹽濃度腌制麻竹筍中細菌微生物區系 UPGMA聚類分析和主成分分析Fig.4 UPGMA cluster analysis and principal component analysis of the bacterial in pickled Ma bamboo shoots with different salt concentration

2.5 腌制麻竹筍細菌進化分析

在屬分類水平上相對豐度前25位的微生物發育進化樹如圖5所示。其中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的發育進化最簡單，在系統發育進化樹中獨占一支，是腌制麻竹筍發酵過程中的核心菌群。氣球菌屬(Aerococcus) 與未鑒別的乳桿菌目(unclassified_Lactobacillales)遺傳距離較近，擬桿菌門(Bacteroidales_S24-7_group)與擬桿菌屬(Bacteroides)遺傳距離較近，屬于同一支，但兩者發育程度差異較大。未鑒別的消化鏈球菌科(unclassified_Peptostreptococcaceae)與土孢桿菌屬(Terrisporobacter)遺傳距離較近，乳球菌屬(Lactococcus)和腸球菌屬(Enterococcus)遺傳距離較近。隸屬于變形菌門 (Proteobacteria)的幾個菌屬親緣關系也較近。右側柱狀圖顯示，隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的Lactobacillus、Aerococcus、Lactococcus和魏斯氏菌屬(Weissella)均具有較高占比，其次是隸屬于藍細菌門(Cyanobacteria)的Cyanobacteria_norank，而隸屬于變形菌門 (Proteobacteria)的海細菌屬(Marinobacterium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等菌屬占比雖較低，但種類豐富，因此厚壁菌門、藍細菌門和變形菌門是腌制麻竹筍的核心菌門。其中，Lactococcus、Weissella、鹽單胞菌屬(Halomonas)、unclassified_Peptostreptococcaceae在低鹽濃度樣本中占比顯著高于高鹽濃度樣本，而Lactobacillus、Aerococcus、Cyanobacteria_norank和Marinobacterium則在高鹽濃度樣本中占比更大，正是這些菌屬導致了不同鹽濃度樣本中細菌群落結構的差異。

3 討論

腌制麻竹筍在不同的發酵環境及生產工藝下，微生物的群落結構及演替各異。過去研究人員采用生理學試驗、高通量測序和多重PCR等方法對各類腌制發酵蔬菜中的微生物群落進行研究，普遍發現細菌，尤其是乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是參與發酵過程的主要菌種[6, 8, 15]。因此，本研究將焦點放在探索腌制發酵麻竹筍中細菌群落動態演替及其與發酵液中鹽濃度的內在聯系上。發酵第1天2種鹽濃度樣本中LAB的含量均較低，此后其相對豐度激增，成為群落中的優勢生物。這可能意味著只有微量的LAB才是啟動發酵所必需的，也代表2種鹽濃度下麻竹筍均腌制發酵成功[16]。在5 g/100mL鹽質量濃度樣本中檢測到的LAB包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和微量的明串珠菌屬(Leuconostoc)，而在15 g/100mL鹽質量濃度樣本中僅有Lactobacillus一種LAB的平均相對豐度>1%并發揮主導作用，側面反映出Lactococcus、Weissella以及Leuconostoc對高滲透壓環境耐受力較差。Lactobacillus是傳統發酵蔬菜中的典型微生物群落[16]，但本課題組前期采用PCR-DGGE技術對6 g/100mL鹽質量濃度下腌制麻竹筍研究中僅檢測到優勢菌屬Lactococcus和Weissella[12]，說明Illumina平臺測序作為一種靈敏度更高的宏基因組學研究手段，能有效檢測到更多細菌種屬，得到更為準確的細菌多樣性研究結果。

a-系統發育進化樹(樹枝的顏色對應菌屬所屬的菌門)；b-菌屬在2種鹽濃度樣本中的Reads占比圖5 不同鹽濃度腌制麻竹筍中細菌屬水平系統發育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of the bacterial in pickled Ma bamboo shoots with different salt concentration at genus level

5 g/100mL鹽質量濃度樣本發酵中期(3～14 d)LAB占據絕對優勢地位，此階段也是整個發酵過程中雜菌最少的階段，可能是因為LAB消耗發酵環境中的營養基質搶占其他菌屬的生存空間，并且LAB適應環境后代謝產酸降低發酵環境pH值，還能產生細菌素進一步抑制雜菌滋生[17-18]。然而愈加酸化的環境反過來抑制了Lactococcus和Weissella的生長，使得這2種LAB走向衰亡[19]。此后雜菌數量迅速增加，在腌制第28天時，鹽單胞菌屬(Halomonas)替代了Lactobacillus的絕對優勢地位，腌制第35天細菌群落多樣性激增，尤其是擬桿菌門(Bacteroidetes)、螺旋體(Spirochaetae)、梭桿菌門(Fusobacteria)及一些相對豐度<1%的雜菌。值得一提的是，15 g/100mL鹽質量濃度下僅在發酵第35天時細菌群落多樣性有短暫的增加，后又恢復到穩定水平，說明高鹽質量濃度能夠有效抑制雜菌生長，提高腌制麻竹筍的食用安全性。藍藻細菌屬(Cyanobacteria_norank)和海細菌屬(Marinobacterium)在2種鹽濃度樣本的發酵初期均屬于優勢菌屬，可能對構建發酵環境中的微生物菌群結構具有重要作用。Cyanobacteria_norank在15 g/100mL鹽質量濃度樣本發酵過程中貫穿始終，與Lactobacillus及氣球菌屬(Aerococcus)一起組成了高鹽腌制條件下麻竹筍發酵達到穩態時的主要菌屬。李恒等[20]發現，Cyanobacteria_norank和Lactobacillus也是達到穩態的泡菜母水中的主要細菌屬。Aerococcus為兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，模式種為綠色氣球菌(A.viaid-ans)，有研究[21]顯示其能在NaCl質量濃度不低于100 g/L的環境中存活，但顯然15 g/100mL鹽質量濃度條件也不能阻礙其生長。本課題組前期在鹽質量濃度為19 g/100mL的腌制麻竹筍中也檢測到了綠色氣球菌[11]。由此可見，低鹽濃度樣本發酵過程以LAB為優勢菌群，發酵后期LAB消亡，單純依靠發酵前期LAB產生的有機酸難以抵抗雜菌滋生；而高鹽濃度樣本則以耐鹽或是抗逆性較強的菌屬為主要菌屬，發酵過程中菌群多樣性較低鹽濃度樣本小，但菌群結構穩定，顯著抑制了雜菌滋生。

腌制發酵蔬菜的品質與風味特性很大程度上取決于駐留的微生物群落和發酵條件[8]。LAB對腌制發酵成功與否具有決定性作用，它們產生有機酸、細菌素、維生素和香氣化合物，這些物質能夠有效影響發酵食品的保質期、營養成分和感官特性[16]。其中，Leuconosto和Weissella通過異乳酸發酵途徑啟動發酵，產生有機酸、乙醇、乙醛、甘露醇等風味物質，創造有利于其他乳酸菌生長的環境的同時還能保持蔬菜顏色[22-23]。蔬菜發酵后酯類、醇類和醛類等揮發性風味物質含量的增加則與Lactobacillus等微生物的變化密切相關[24]。此外，隸屬于變形菌門(Proteobacteria)的假單胞菌屬(Pseudomonas)豐度的增加也可能是導致腌制竹筍中風味化合物產生的原因[25]。然而除Lactobacillus外，其余LAB在15 g/100mL鹽質量濃度樣本中相對豐度均較低，并且Pseudomonas僅在5 g/100mL鹽質量濃度樣本發酵28～35 d有明顯的增殖，間接說明低鹽濃度樣本風味品質可能優于高鹽濃度樣本。

4 結論

本研究采用高通量測序對5 g/100mL和15 g/100mL 2種鹽質量濃度腌制條件下麻竹筍發酵過程中的細菌群落結構進行研究。發酵前28 d 2種鹽濃度樣本中細菌群落豐富度差異較小，5 g/100mL鹽質量濃度樣本中以乳酸桿菌屬、乳球菌屬和魏斯氏菌屬為優勢菌屬，而15 g/100mL鹽質量濃度樣本則以藍藻細菌屬、氣球菌屬和乳酸桿菌屬為主要菌屬。發酵進入第35天后，5 g/100mL鹽質量濃度樣本中細菌群落豐富度及多樣性均顯著增加，群落結構發生較大改變，而15 g/100mL鹽質量濃度樣本菌群豐富度小幅增加后迅速恢復至穩定水平，群落結構未發生較大改變。本實驗僅對不同鹽濃度腌制條件下麻竹筍發酵過程中細菌群落的動態演替進行了鑒定，進一步的研究可利用熒光定量-PCR技術對不同發酵期微生物進行定量檢測，與腌制麻竹筍的揮發性風味物質進行關聯分析，以期為麻竹筍腌制過程中風味形成機理研究及質量控制提供參考依據。