小檗堿調控PI3K/AKT信號通路干預糖尿病動脈硬化的實驗研究

朱昌國， 李 帥， 孫艷君， 王玉濤， 孫 巖

(1.山東省濟南市人民醫院全科醫學科， 山東 濟南 271100 2.山東省濟南市中醫醫院周圍血管病科， 山東 濟南 250012 3.山東第一醫科大學附屬省立醫院血管外科， 山東 濟南 250021)

全世界約有4.25億人罹患2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)，到2045年，這一數字可能增長為6.93億[1]。糖尿病動脈硬化(diabetic atherosclerosis, DA)是T2DM的并發癥之一，可導致肢體缺血、糖尿病足等嚴重不良后果。T2DM誘發DA的具體機制尚不完全明確。小檗堿(berberine, BBR)屬生物堿，是中藥黃連的主要成分。近年來，隨著現代藥理學研究的深入，BBR干預T2DM的效果已被證實[2]，且有研究表明，BBR具有抗動脈粥樣硬化的作用[3]。在前期的研究中，本課題組利用網絡藥理學工具探索發現，BBR可能通過調控PI3K/AKT信號通路發揮治療DA的作用。基于上述理論，課題組擬通過實驗研究，觀察PI3K/AKT信號通路在DM模型大鼠腹主動脈中的表達變化及BBR的干預作用，為DA的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物:SPF級SD雄性大鼠70只，7周齡，體重(180±20)g。由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(魯)2019-0003。每籠飼養5只大鼠，自由飲水，室溫維持在(20±2)℃，普通全價顆粒飼料喂養，適應1周后開始實驗。

1.2實驗儀器:見表1。

表1 實驗儀器

1.3藥物及試劑

1.3.1實驗用藥及制備：鹽酸小檗堿溶液(50mg/mL)：鹽酸小檗堿購于上海麥克林生化科技有限公司，純度98%，黃色至橙色粉末。溶液制備方法：稱取10g鹽酸小檗堿，加入200mL生理鹽水混勻。

1.3.2主要試劑:見表2。

表2 主要試劑

1.4實驗方法

1.4.1建立動物模型：① STZ溶液制備:用0.1M無菌檸檬酸鈉緩沖液配制濃度為1%的STZ溶液(PH 4.4)。②分組及造模:將大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、糖尿病模型組(DM組)和鹽酸小檗堿干預組(BBR組)。DM組和BBR組大鼠禁食12h后，按照35mg/kg標準腹腔注射STZ溶液；NC組大鼠腹腔注射相同劑量的無菌檸檬酸鈉緩沖液，造模72h后，尾靜脈取血測血糖，血糖≥16.65mmoL/L為造模成功[4]。排除造模過程中死亡和造模后未達標的大鼠，每組選用20只開展實驗。

1.4.2干預方法：BBR組按照100mg/kg/d的標準每日灌胃給藥；DM組和NC組每日給予相同劑量的生理鹽水灌胃；每周根據大鼠重量調整用藥劑量，連續灌胃6周。

1.4.3標本取材：各組大鼠禁食12h，按照3mL/Kg的標準，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定于動物手術臺上，修剪腹毛，沿腹部正中進入腹腔，顯露腹主動脈，收集血液，將腹主動脈標本迅速置入4%多聚甲醛中固定。

1.4.4指標檢測:檢測各組大鼠血糖(GLU)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)變化；免疫組化法檢測PI3K、AKT、p21的表達水平，于顯微鏡下觀察標本切片免疫組化染色的顯色，以細胞核和(或)細胞質出現棕黃色顆粒為陽性。用Image J軟件測定標本切片染色的平均光密度值(OD)。

2 結 果

2.1一般情況:造模前各組大鼠體重差異無顯著統計學意義(P>0.05)。造模后，NC組大鼠正常進食，體重平穩增長。DM組和BBR組大鼠活動量減少，進食飲水量增多，尿量增加。與NC組大鼠相比，DM組和BBR組大鼠體重明顯下降，差異有顯著統計學意義(P<0.05)；DM組與BBR組大鼠體重差異無顯著統計學意義(P>0.05)(見表3，圖1)。

表3 造模前后各組大鼠體重變化(g)

2.2血糖水平變化:造模后，DM組和BBR組大鼠血糖水平較造模前及NC組大鼠升高，差異有顯著統計學意義(P<0.05)；DM組和BBR組大鼠血糖水平差異無顯著統計學意義(P>0.05)。經藥物干預后，BBR組血糖水平較治療前降低，差異有顯著統計學意義(P<0.05)；DM組和NC組大鼠治療前后血糖水平無明顯變化(P>0.05)(表4，圖2)。

表4 治療前后各組大鼠血糖水平變化(mmoL/L)

圖1 造模前后各組大鼠體重變化

圖2 治療前后各組大鼠血糖水平變化

2.3血脂水平變化：各組大鼠TC、TG治療前后差異無顯著統計學意義(P>0.05)；各組大鼠之間TC、TG差異無顯著統計學意義(P>0.05)(表5、6，圖3)。

表5 各組大鼠治療前后血清總膽固醇水平變化(mmoL/L)

表6 各組大鼠治療前后甘油三酯水平變化(mmoL/L)

圖3 各組大鼠治療前后血脂水平變化

2.4免疫組化結果：灌胃6周后，免疫組化檢測各組大鼠腹主動脈PI3K、AKT、p21表達水平。結果顯示：與NC組大鼠相比，DM組及BBR組大鼠PI3K表達水平明顯升高，差異有顯著統計學意義(P<0.05)；與DM組相比，BBR組PI3K表達水平明顯降低，差異有顯著統計學意義(P<0.05)；與NC組大鼠相比，DM組及BBR組大鼠AKT表達水平明顯升高，差異有顯著統計學意義(P<0.05)；與DM組相比，BBR組AKT表達明顯降低，差異有顯著統計學意義(P<0.05)；與NC組大鼠相比，DM組大鼠p21表達水平降低，BBR組大鼠p21表達水平明顯升高，差異有顯著統計學意義(P<0.05)；與DM組相比，BBR組p21表達明顯升高，差異有顯著統計學意義(P<0.05)(表7，圖4～8)。

表7 各組大鼠免疫組化結果(OD值)

圖4 各組大鼠PI3K免疫組化結果

圖5 各組大鼠PI3K免疫組化染色(×400)

圖6 各組大鼠AKT免疫組化染色(×400)

圖7 各組大鼠p21免疫組化結果

圖8 各組大鼠p21免疫組化染色(×400)

3 討 論

BBR是中藥黃連的主要成分。既往的研究證實，BBR可以通過調節脂質代謝、改善血管平滑肌細胞增殖和抑制炎性反應等途徑發揮抗動脈硬化作用[5]。此外，BBR還可以降低糖尿病模型大鼠的血糖水平，通過抑制炎性反應、抗氧化等途徑干預糖尿病[6]。但BBR是否能調控PI3K/AKT信號通路干預糖尿病動脈硬化發病，尚缺乏研究。

本研究以糖尿病模型大鼠為研究對象，觀察BBR對模型大鼠腹主動脈PI3K/AKT信號通路的干預作用。在動物模型制備方面，鑒于STZ誘導大鼠糖尿病模型的性別差異和年齡體重差異，本研究選用7周齡、體重(180±20)g的SD雄性大鼠為研究對象，采用STZ腹腔注射的方法制備糖尿病大鼠模型，模型大鼠均符合實驗需求。

諸多研究證實，BBR可以通過改善胰島素抵抗、促進胰島素及胰高血糖素樣肽-1的分泌、抑制肝臟糖異生、減少腸道細胞對糖的攝取吸收、抑制氧化應激及炎性反應、調控腸道菌群等途徑降低血糖水平[7]。結果表明，經治療，BBR組大鼠血糖水平較治療前降低，且低于DM組大鼠血糖水平，再次證實了BBR的降糖作用。除血脂異常外，高血糖導致的炎性反應是動脈硬化發病的重要因素。研究證實，頸動脈粥樣硬化斑塊的檢出率與患者空腹血糖、血糖動態變化以及糖化血紅蛋白的水平具有相關性，提示高血糖是發生動脈硬化的獨立危險因素之一[8]。此外，高血糖水平可以激活核轉錄因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號通路及其下游的細胞間黏附分子(intercellular cell adhesion molecule-1, ICAM-1)的表達水平，促進動脈內皮細胞內炎性因子的聚集和黏附，誘導動脈硬化發病[9]。為驗證高血糖對動脈硬化發病的獨立影響，本研究采用鏈脲佐菌素腹腔注射的方法構建糖尿病大鼠模型，以普通全價顆粒飼料喂養并開展實驗研究，結果表明，各組大鼠TC、TG治療前后以及組間比較差異無顯著統計學意義，表明該造模方法未對大鼠血脂水平產生影響。

本研究采用免疫組化技術檢測了模型大鼠腹主動脈標本PI3K、AKT、p21的表達，發現大鼠糖尿病模型復制成功后，其腹主動脈PI3K、AKT的表達較正常對照大鼠顯著升高，而p21的表達則減少；經BBR干預的糖尿病模型大鼠，腹主動脈PI3K、AKT的表達較糖尿病模型大鼠減少，p21的表達增加。上述結果表明，糖尿病模型大鼠腹主動脈PI3K、AKT的表達增加，p21的表達減少，這可能是糖尿病動脈硬化發病的機制之一；BBR可以降低糖尿病模型大鼠血糖水平，減少其腹主動脈PI3K、AKT的表達并上調p21的表達。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphoinositide 3-kinases/protein kinase B, PI3K/AKT)信號通路廣泛參與調控細胞的生長、增殖和分化。近年來，PI3K/AKT信號通路參與動脈硬化發病的研究愈加深入。已有研究證實，與血管內皮細胞損傷的多種信號分子與PI3K/AKT信號通路關系密切，PI3K/AKT信號通路可以通過影響血管內皮細胞的途徑，干預動脈硬化發病[10]。此外，研究證實PI3K/AKT參與炎性反應和脂質代謝途徑，抑制PI3K/AKT信號通路能夠降低動脈硬化模型小鼠血清游離脂肪酸、膽固醇和甘油三酯水平[11]。PI3K/AKT信號通路還可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等促炎介質水平[12]。AKT是PI3K信號通路中處于核心地位的蛋白激酶。在PI3K作用下，AKT可被磷酸化為p-AKT，參與下游因子的激活。國內學者研究發現，C57BL/6動脈硬化模型小鼠的PI3K和p-AKT表達水平顯著提高[13]。內皮細胞增殖是動脈硬化發病的重要過程。p21是細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)的抑制因子，可以負向調節細胞周期，即過表達p21，可抑制細胞增殖[14]。研究表明[15]，動脈粥樣硬化病理狀態下，動脈平滑肌細胞內p21表達減少，促使平滑肌細胞增殖，參與動脈硬化發病。上述研究表明，PI3K/AKT信號通路與動脈硬化的發生發展關系密切。

綜上所述，BBR可能會通過調控PI3K/AKT信號通路，發揮抑制細胞增殖等作用，干預糖尿病動脈硬化發病。但糖尿病動脈硬化病理過程復雜，且PI3K/AKT參與細胞增殖、凋亡等多種生理病理過程，本研究僅驗證了BBR對糖尿病動脈硬化模型大鼠腹主動脈PI3K/AKT信號通路的干預作用，未能對多靶點多通路在糖尿病動脈硬化病理過程中的交互作用開展研究，存在一定的局限性。糖尿病動脈硬化的病理機制和治療靶點需要進一步研究。