膠質瘤細胞體外培養技術及應用研究進展

敬聰 丁向前 王君 鄒楊鴻 王志剛 余化霖 耿鑫

神經膠質瘤是顱內腫瘤中最常見的惡性腫瘤。神經系統惡性腫瘤中，膠質瘤約占80%，目前最常見的治療方法是手術切除、放療、化療[1]。高級別惡性膠質瘤在成人原發性腦腫瘤中最常見，通過外科手術、放化療等積極治療，1年和5年生存率分別為30%和13%[1]。膠質母細胞瘤的侵襲程度最高，確診后患者僅有15個月左右的的中位生存期，5年生存率為也僅為6.8%[2]。而引起這個結果的原因是膠質瘤細胞具有高度侵襲性，使得外科手術難以完整切除膠質瘤腫瘤組織；同時，由于膠質瘤的生物學特性復雜，對常規放、化療不敏感，導致治療效果極差，常容易復發[1]。手術切除后，大部分患者在手術切緣2～3 cm內復發，因此，需要探索一些新的治療方法。通過對膠質瘤細胞的培養及實驗，可以從從分子、基因等水平等揭示膠質瘤的生物學特性。神經瘤細胞體外培養技術在腫瘤研究方面具有很多獨特的優勢，在神經科學研究中占據重要地位。但神經細胞體外培養條件要求高、難度極大又制約了其發展。因為膠質細胞瘤具有高度異質性，在腫瘤內部的不同細胞以及腫瘤微環境之間具有復雜的相互作用，因此，我們需要找到一個最佳的培養條件，保持分子基因型和表型以及原始腫瘤在體外和體內的異質性。下面本文回顧常見膠質瘤細胞體外培養技術及膠質瘤細胞培養在常用研究中的應用作一綜述。

1 細胞來源

細胞培養為研究過程中維護細胞提供了體外環境，許多培養技術可用于腫瘤和非腫瘤細胞的生長和維護。選擇合適的細胞來源和體外試驗的細胞培養程序與試驗本身同樣重要[3]。

1.1 經典細胞系 膠質瘤的細胞多來自人類和大鼠膠質瘤的細胞株，經典的細胞系如U87MG、U251、U6和T98G等，培養在含有血清的培養基中，隨著傳代次數的增加，其細胞在表型和基因型上與原發性腫瘤存在差異。盡管血清培養的神經膠質瘤細胞可以隨著傳代次數的增加顯示出潛在的致癌能力，但它卻不能反映親本腫瘤的表型[4]。許多目前可用的膠質瘤細胞株缺乏與腫瘤類型、分級、位置、患者年齡等相關的臨床信息，因此難以將研究結果與患者病情和臨床病程相聯系[3]。由于這些原因，傳統建立的細胞系不能提供可靠的模型系統來了解膠質瘤的機制和治療的相互作用。

1.2 患者來源的細胞系 由于膠質瘤細胞原代培養因成功率較低，因此過去大多數研究人員未采用原代培養。隨著培養技術的進步，如今，研究人員更喜歡從原代細胞培養，而不是使用已建立的細胞株，因為它們具有更高的生物學和表型相關性[3]，更適合用于侵襲性、敏感性等基礎實驗，其結果更能接近人體的真實情況，這是未來研究的細胞選擇趨勢。原代細胞通常來自于手術切換的患者標本。組織首先洗去多余的碎屑和血液，被機械碾碎，然后用胰酶和脫氧核糖核酶消化，經過幾次洗滌和離心步驟后，消化的組織被滴定并通過細胞過濾器，最后，細胞通過離心、重新懸浮和培養在神經基質介質中。原代細胞可以在空白的平板中作為非粘附性神經球生長，也可以在層粘連蛋白或聚賴氨酸包被的平板中作為粘附細胞生長[4]。然而，隨著傳代數量的增加(20～30傳代)，培養的患者來源的膠質瘤腫瘤細胞表現出顯著的基因組和轉錄變化[5]。另外，可以將源自患者的神經膠質瘤作為異種移植物直接移植到小鼠體內，而不是保持培養瓶中，然后作為系列異種移植物來保持。這些方法受到某些人的青睞，因為這些條件可再現地保持原始腫瘤的組織病理學，基因組和表型特征[6]。

2 膠質瘤細胞體外培養技術

傳統的細胞培養技術屬于二維(two-dimensional，2D)培養技術，因為其成本低，可操作性強而普及。但隨著研究的深入，研究這發現大多數細胞在正常生理狀態下是三維(three-dimensional，3D)結構，且3D結構的微環境較2D差異較大，所以隨著材料、技術的進步，3D細胞培養技術正逐步普及。

2.1 2D培養技術 單細胞懸浮培養是2D培養技術的一種，它是將離體組織塊通過物理法(金屬網擠壓和尖吸管吹打)或化學法(胰蛋白酶)或兩者結合，以分離出單個細胞，然后接種在培養瓶中進行培養。還有一種是利用新采集的膠質瘤組織，將其附著在培養瓶內，大約1～2 d后，膠質瘤細胞會游離出來，然后再利用游離的膠質瘤細胞進行培養[7]。膠質瘤細胞最初采用懸浮培養法，然而，膠質瘤細胞的特征并不是懸浮生存，也不是它增殖的必要條件。大部分細胞是貼壁生長。貼壁單層細胞有很多實驗優勢，特別是在培養同質性、成像方法、克隆繁殖/挑選、篩選和定量方面，從而克服了懸浮培養的一些固有限制。傳代培養就更簡單，一般將需要的細胞種植在培養瓶，待其達到需要的密度，再是使用胰蛋白酶吹打膠質瘤細胞，然后根據研究需要將膠質瘤細胞接種到對應的培養器械中。

在此基礎上，加支持物進行培養、單細胞分離培養法、球體細胞培養法、懸浮培養方法等培養方法在也膠質瘤細胞單層細胞培養上得到運用，如：加入支持物培養就是預先在培養器械中添加支持物，這樣是為了更好的進行實驗研究及觀察。爬片，就是為了做細胞免疫組織化學分析而設計的，其方法是預先在培養板上放一個小載玻片，然后在其上培養腫瘤細胞，待條件成熟后再取出、固定并染色的一系列過程。單細胞分離培養也稱克隆培養，我國研究者通過虹吸法將SHG-44單克隆化，建立了具有3種不同分化水平的膠質瘤細胞系[8]。球形培養，是將生長成片狀的細胞移動到不容易附著的基底部，并且使細胞片卷曲生長成球狀。馮利強等[9]還運用懸浮培養法培養C6膠質瘤細胞系中腦腫瘤干細胞，并認為該方法與其他方法培養的細胞在形態上無差別。

2.2 3D培養技術 盡管單層細胞培養現在應用廣泛，但培養的細胞遺傳不穩定；它是2D結構，而人體是3D結構。在細胞的生長、發育、分化中，細胞的微環境起著至關重要的作用，針對這些問題，研究人員開始嘗試使用3D系統培養細胞，如腫瘤衍生器官、有機多細胞球體、多細胞腫瘤球體或腫瘤衍生球體，以更好地展示膠質瘤異質性和微環境。此外，在細胞形態上，因為3D培養更能重現人腦微環境，所以通過3D培養技術培養的細胞在形態、功能、生物學特性上更接近于體內存活狀態。Wei等[10]研究顯示，與單層細胞培養相比，用3D系統培養的腫瘤細胞中干細胞相關基因和蛋白表達水平、侵襲能力、惡性膠質瘤和治療耐藥均有所增加。盧虎生等[11]利用2D及3D培養分別對U251膠質瘤細胞系進行培養，結果發現通過3D培養的U251細胞系增殖速度更快，增殖指數、細胞周期、免疫組化等結果更接近于臨床標本。所以，在3D培養中培養的神經膠質瘤細胞更能反映出細胞本身的行為及特性[12]。Gomez-Roman等[13]利用2D和3D系統中培養出相同膠質瘤細胞系，對放射敏感性的結果卻相反，3D系統培養的細胞對放射線敏感，而2D系統培養的細胞對放射線無反應。這些結果為傳統二維細胞培養系統的結果經常未能預測臨床療效提供了潛在的解釋，而且這種現象也會導致不當和過度使用動物試驗。

然而，3D培養也有不足之處，如它不能100%模擬人體內微環境、細胞生長到已成程度時營養缺乏等，但是這些問題現在我們已經在慢慢解決。如生物打印技術的進步，使得我們現在可以進行復雜的多細胞3D環境組裝。Duarte等[14]利用生物打印將內皮細胞、基質細胞和永生化的神經母細胞瘤細胞排列成膠質瘤樣水凝膠，其具有獨特的空間特征模仿了人類大腦的解剖結構。在腦類器官內共培養腫瘤細胞會導致腫瘤形成和侵襲，其模式與患者的手術標本相似。從準確的解剖學模型上得的藥物和侵襲研究，但仍缺少生物學相互作用。

2.3 其他培養方法 將兩種或兩種以上的細胞一起培養，稱為共培養方法，不過其本質也是單層細胞培養技術。李振業等[15]利用共培養體系，培養惡性膠質瘤細胞和血管內皮細胞研究CD、VEGFR-1基因，結果顯示該基因對細胞VEGF的表達及細胞增殖有抑制作用。另有將球狀細胞培養和單層培養相結合，以提高在無血清條件下的人膠質瘤細胞系的衍生效率。所以體外共培養模型為現在不能解決的問題提供了一個獨特的思路。除了上述培養方法以外，還有研究人員將兩種及兩種以上的方法聯合應用，如同時采用單層培養及3D培養。還有學者利用將水凝膠使用在體外培養體系中作為涂層材料或3D生長系統來模擬腫瘤微環境，較普通培養瓶效果明確。還有目前一些新的培養技術如人源腫瘤異種移植模型、迷你大腦模型、腦片技術等等。這些方法其本質仍是上述培養技術，僅是利用很多新技術來改變膠質瘤細胞的培養環境，不過這些新穎的模型可以更好地概括腫瘤動力學和微環境的相互作用，從而能夠更準確地了解膠質瘤的生物學特性。

3 膠質瘤細胞在各類研究中的應用

3.1 藥物研究 膠質瘤細胞對化療敏感性差，主要是因為目前尚缺乏敏感有效的化療治療藥物，而且由于血腦屏障及耐藥性的存在，使得膠質瘤的治療效果相對較差[1]。因此我們需要新的藥物來治療膠質瘤，這使細胞培養顯得尤其重要。

胡燕玲等[16]研究顯示，地塞米松可在G1到S轉折點阻滯C6 細胞周期，從而抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡。Das等[17]通過對U87-MG細胞系研究，先使用地塞米松，再使用莫奈唑胺，膠質瘤細胞系不會凋亡，從而指導我們在臨床治療膠質瘤患者中，合理使用地塞米松。趙艦等[18]研究發現，百消安可以膠質瘤細胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達，從而抑制U87細胞系的增殖，促進其凋亡形成。

中藥是我國的傳統文化，中藥治療膠質瘤也是目前的熱門研究方向。陳雪等[19]研究表明，五味子甲素通過下調CyclinD1蛋白表達水平、上調促凋亡因子Bax和Bcl-2表達水平而抑制C6細胞的生長。Liu等[20]對雷公藤的研究中發現，雷公藤紅素在U251、U87-MG和C6細胞系以及動物模型中可誘導G2/M期阻滯和細胞凋亡，增加自噬體形成，進一步研究顯示雷公藤通過激活ROS/JNK信號通路，阻斷Akt/mTOR信號通路，引起G2/M期阻滯，觸發細胞凋亡和自噬。吳海霞[21]在膠質瘤動物和細胞模型研究發現，川芎揮發油聯合莫奈唑胺與莫奈唑胺單獨給藥相比，聯合用藥組的腫瘤抑制效果更好，而且抑瘤效果與川芎揮發油的濃度呈正相關。趙亞鵬等[22]對膠質瘤細胞系T98G和LN18予以不同濃度的重樓皂苷Ⅱ處理，發現其可降低膠質瘤的增殖及侵襲性，進一步研究發現其還能增加替莫唑胺對膠質瘤的抑制。

3.2 放射敏感性研究 不同膠質瘤細胞系特點不一樣，研究顯示T98和MO54細胞系對輻射敏感性完全相反[23]。Ostruszka等[24]研究發現，U251細胞系比D54細胞系在受到放射線時更敏感，存在這種差異的原因是P53基因是突變型還是野生型。Chen等[25]在靶向輻射增敏的研究中也運用了突變型和野生型P53兩個膠質瘤細胞系，證明P53基因是膠質瘤細胞系放射線敏感與否的關鍵因素。劉宇馳等[26]對U373細胞進行研究顯示，下調磷酸甘油酸激酶1(PGK1)，可以影響CIN、切絲蛋白1表達，從而使U373細胞的對放療更敏感。王冉冉等[27]研究顯示，通過對膠質瘤U251和RR-U251細胞系進行研究發現，升高 TPM1的表達，可以明細提高膠質瘤細胞的放射敏感性，提示TPM1可能是膠質瘤放射敏感相關的潛在靶點。李文清等[28]研究顯示，對膠質瘤U251細胞系給予放射治療，發現CDK7抑制劑THZ1具有降低細胞修復的能力，誘導細胞產生凋亡，增加放射敏感性。

3.3 免疫治療研究 目前，膠質瘤的免疫治療是一大熱門，因膠質瘤的自身生物學特性，即使在外周血中檢測到循環腫瘤細胞，但其幾乎不會轉移到顱外。進一步的研究證實外周環境對膠質瘤細胞具有免疫作用，所以現在亟需明確其免疫學機制。Friese等[29]使用人和鼠的膠質瘤細胞系來研究NK，γδT和CD8+T細胞的腫瘤免疫刺激腫瘤細胞表達，激活免疫受體NKG2D。在膠質瘤細胞中，PD-L1高表達[30]。在膠質瘤微環境中，PD1/PD-L1信號傳導可以影響早期T細胞活化，抑制膠質瘤細胞毒性、增生和促炎細胞因子的產生。由于中樞神經系統的免疫反應低，膠質瘤與其他腫瘤相比在以PD-1為靶點治療的效果較差。同時，由于膠質瘤的多樣性，不同膠質瘤存在異質性，導致微環境也具有差異性，也使得利用PD1/PD-L1的治療方法出現更多挑戰。單克隆抗體是腫瘤免疫治療的主要方向，mAbs具有誘發直接細胞殺滅和調節細胞免疫反應的潛力，表皮生長因子受體 (EGFR) 的突變代表了膠質瘤關鍵遺傳特征，直接針對 EGFR 的 mAb 被用作膠質瘤中眾所周知的治療方法。

腫瘤疫苗也是免疫研究的一部分，因其能夠激勵宿主免疫系統識別和殺死腫瘤細胞，如膠質瘤疫苗可以使用樹突細胞(Dendritic cells，DCs)制備，主要是因為DCs作為傳遞細胞，激活細胞毒性T細胞的抗腫瘤作用。陳興勝等[31]通過研究顯示，通過上調腦膠質瘤細胞DCs中凝血酶敏感蛋白1的表達，可以抑制DCs的成熟，使其分泌的細胞因子具有免疫抑制作用。曾山等[32]將C6細胞、9L細胞及其裂解物作為免疫原來制備疫苗，用它來降低載瘤大鼠膠質瘤組織的侵襲性，延長大鼠的生存期。Tang等[33]對具有免疫活性小鼠上的GL261腫瘤采用疫苗 IL15Rα聯合T細胞治療、雷帕霉素和塞來昔布治療，發現很好的抗腫瘤效果。

溶瘤病毒(oncolytic virus,OV)治療是近年來新型的具有特異性腫瘤治療方法，其基于病毒在癌細胞中的選擇性復制和隨后的破壞作用，其最初被認為是與免疫治療分開的一種治療策略，然而，溶瘤病毒感染引起的抗腫瘤免疫反應模糊了這一區別[34]。由于血腦屏障的存在，導致化療無法達到滿意的效果，而OV由于其具有較小結構，對于神經系統腫瘤的治療具有獨特的優勢。歐陽一彬等[35]利用膠質瘤GL261細胞系體外實驗證實，重組溶瘤腺病毒Ad3-aLAC可抑制膠質瘤細胞增殖，同時在體內實驗顯示其可增強抗腫瘤的免疫反應，為膠質瘤的OV治療提供新的思路。

3.4 建立動物模型 動物模型在研究膠質瘤的發病機制、特征等方面有重要意義，而動物模型的建立同樣需要應用膠質瘤細胞的培養。汪柳旭等[36]在Balb/c裸鼠右側背部下方接種U87膠質瘤細胞，建立鼠膠質瘤載瘤模型，用于膠質瘤治療方面的研究。Kim等[37]研究PD-1、抗TIM-3與放射治療的聯合治療效果，為免疫治療與放射治療的聯合治療提供了新的策略。雖然動物模型可以提供與人體十分接近的膠質瘤生存的微環境，但是腫瘤細胞難以直接觀察和追蹤，造模價格通常十分昂貴，且缺乏可重復性。

3.5 其他研究中的應用 除了上述研究外，神經膠質瘤細胞培養還廣泛用于其他研究領域，例如探索膠質瘤細胞凋亡與侵襲轉移機制研究。Zhang等[38]使用原代培養的神經膠質瘤細胞和原代培養的星形細胞研究惡性神經膠質瘤細胞與星形膠質細胞之間的直接間隙連接，發現與膠質瘤細胞的直接細胞耦合會導致星細胞的表型轉化，從而增加膠質瘤對周圍組織的易感性。胡斌[39]通過研究對人腦膠質瘤細胞U251發現，抑制PI3K/Akt通路，能增加膠質瘤細胞的凋亡。江曉珍等[40]對膠質瘤細胞株U87MG、U251研究發現，巨噬細胞移動因子通過PI3K/Akt途徑抑制膠質瘤細胞的凋亡。劉紀營等[41]對U87膠質瘤細胞系研究發現，利用RNA技術下調膠質瘤細胞的KIF20A表達，可以抑制其增殖、遷移及侵襲能力，誘導細胞周期G0/G1期阻滯，促進其凋亡形成。李梅等[42]首次發現光動力學療法對C6膠質瘤細胞具有殺傷作用。還有一些如長鏈非編碼RNA，微小RNA等對膠質瘤的治療或侵襲性機制的研究。還有一些未列出的研究，其都顯示了細胞培養技術在研究中的重要性。

神經膠質瘤因其獨特的侵襲性而困擾研究人員，為了延長膠質瘤患者生存率，明確驅動遷移和侵襲的關鍵機制十分重要。體外方法是預測膠質瘤細胞如何侵襲的重要手段，與體內模型相比，更容易操作和復現，且成本較低。目前膠質瘤細胞培養方法眾多。目前最熱門的培養方法是3D培養技術，因其可以近似的模擬腦內微環境，更準確的反映膠質瘤細胞的生物學特性，更有效的尋找藥物治療靶點及藥物開發。膠質瘤干細胞如今也是一個新的研究熱點，該研究未來可能稱為治療膠質瘤的新的方向。相信隨著生物醫學工程技術的進步，在膠質瘤細胞培養技術可以得到升級，也會應用到一些目前未知的新的領域。

而且，選擇適當的細胞系和細胞培養條件對于保持神經膠質瘤腫瘤的侵襲行為至關重要。例如，神經膠質瘤中干細胞和非干細胞群體的組成受微環境影響并影響遷移潛力，因此以維持這些細胞群體的培養方式至關重要[43]。此外，患者來源神經膠質瘤細胞可以更好的顯示膠質瘤的生物學特性，在研究腫瘤的藥物敏感性和反應性時可能更有益。

使用體外測定的目的是在不顯著損害體內環境的情況下平衡成本和可重復性，以更準確和有效地解決特定的生物學問題。只有當體外的培養體系與人體環境更相似時，我們針對膠質瘤的治療方法的研究才能更加深入，且更具有針對性，且更加有效。因此，在選擇培養方法時，必須考慮其能多大程度上重建體內環境，而且必須權衡其可重復性、難易程度和成本。