p16/ki-67雙重染色在宮頸癌篩查中的應用分析

葉靜，王炯，劉曉清，卜相冉

(1. 長治醫學院，山西 長治 046000；2.山西省長治醫學院附屬和濟醫院婦科，山西 長治 046000)

1 宮頸癌病變機制

宮頸癌作為我國女性常見惡性腫瘤之一，其發病機制復雜多樣，研究證明，高危型HPV持續感染是導致宮頸癌的主要病因，其可能發生的機制為：高危型HPV在持續感染宮頸上皮細胞的過程中, 將病毒DNA通過非同源重組的方式整合到宿主細胞基因組,大量轉錄兩個主要致癌基因E6、E7的mRNA,導致HPV E6/E7癌蛋白高表達，兩種蛋白以協作的方式引起上皮細胞永生化，而這是腫瘤惡變的前提。深入研究發現[1]，E6和E7蛋白轉化細胞的能力在一定程度上與另外兩種細胞內蛋白P53蛋白和視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,Rb)相互作用有關；相關具體機制將在下文詳細闡述。

2 p16/ki67雙重染色用于宮頸癌篩查或診斷的原理

2.1 p16基因分析

2.1.1 p16基因特點

l994年Kamb[2]等人首次提出并報道了pl6基因，該基因是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitorCKIS)家族成員，定位于人第9號染色體短臂2區l帶(9p2l)，可編碼多種蛋白，其中p16INK4a蛋白作為其編碼產物之一，主要在細胞核內發生作用，包括直接參與細胞周期的核心調控，促進細胞分裂停止，終止細胞生長，另一方面，進一步誘導生長細胞發生凋亡，從而發揮抑癌基因的作用。在人體內，p16基因的作用主要為以下幾個方面：①在細胞周期中，p16負調控pRb-E2F通路；②p16基因產物p16INK4a蛋白可與細胞周期蛋白D(Cyclin D)競爭性結合細胞周期依賴性激酶(Cell cycle dependent kinase：CDK)CDK4/6，干擾CDK4/6與細胞周期蛋白D的結合，阻止細胞從G1期發展至S期，抑制細胞增殖，防止惡性變；③與JUNK1/3相互作用，抑制其激酶活性；④隨著細胞衰老p16相關蛋白會異常增加，高水平的p16相關蛋白會誘導干細胞及癌前腫瘤細胞衰老。

2.1.2 p16基因與腫瘤關聯性在人體內，多種因子參與抑癌基因

和癌基因相互作用，保證機體內部處于相對平衡狀態。p16基因是人們發現的第一個直接作用于細胞周期、抑制細胞分裂的基因，作為一種抑癌基因與許多種惡性腫瘤的發生和發展均有關系，所以也稱為多重腫瘤抑制基因。正常細胞內存在p16-CyclinD-pRb通路，該通路可維持正常細胞周期進行，其中，CyclinDl與CDK4、CDK6形成的復合物，促進細胞內的Rb磷酸化，使與Rb結合的轉錄因子(Transcription factor)E2F釋放，E2F可使細胞周期繼續進行，當細胞受損或 DNA異常時，pl6與CyclinD競爭結合CDK4，從而抑制Rb磷酸化修飾，使轉錄因子E2F無法解離出來而抑制細胞周期進程，阻止不正常細胞進入細胞周期，最終抑制細胞的增殖和惡性轉化；當pl6發生基因缺失、突變或甲基化等機制導致通路下調使pRb失活而不能正常表達時，突變的Rb基因編碼的蛋白質不能與E2F結合，使其能夠不斷啟動基因表達合成大量的DNA聚合酶，促進細胞分裂，導致細胞周期發生紊亂而引起癌變[3]，因此有研究顯示許多惡性腫瘤都存在p16基因表達異常，進一步研究還顯示p16-CyclinD-pRb通路中多種因素所導致E2F過度活化是腫瘤細胞周期中該通路負反饋調節通路異常的核心機制，也是惡性腫瘤發生和演進的重要早期分子事件[4]，提示該通路的異常在宮頸病變中也可能會發生。

2.1.3 p16基因與宮頸病變的關聯

在宮頸從正常組織進展為癌組織的漫長過程中，抑癌基因表達失活和癌基因的表達激活是其細胞癌變的分子基礎。在正常情況下，根據p16在細胞中的作用機制，若細胞出現過度生長，該基因應出現表達下調的現象，但在對宮頸癌機制的研究中發現，在宮頸病變細胞中，p16基因不存在低表達或者是基因的失活現象，相反，pl6基因在宮頸癌組織以及高度內皮瘤樣組織中出現過表達，部分研究證實，存在這種現象的主要原因可能是：HR-HPV E7癌蛋白可結合pRb-E2F通路中的磷酸化Rb(pRb)，使其磷酸化失活，導致了pRb-E2F復合物分離，游離E2F增加，促進了腫瘤細胞的過度增殖，同時pRb-E2F復合物的濃度持續性降低，解除了對pl6基因表達的負反饋抑制，從而導致了pl6基因的過表達[5,6]；因此，當宮頸細胞化學免疫染色出現p16高表達，強烈提示宮頸已發生病變，部分研究證實，p16蛋白在子宮頸炎癥、鱗化、萎縮、不成熟化生、移行細胞化生、修復性改變等組織當中并無陽性表達或是僅為微量表達，在纖毛細胞及未成熟鱗化細胞中意外表達；隨著宮頸病變程度的加重，p16INK4a蛋白在組織學發展過程中的陽性表達程度逐漸增強[7]，Tian Q等[8]研究p16INK4a在宮頸鱗癌及宮頸上皮內瘤變組織中的表達時發現，p16INK4a在鱗癌組織CIN中有豐富的表達，而在正常宮頸組織中不表達；Grace D等[9]在研究HR-DNA感染的宮頸鱗癌中也存在p16的過表達現象。

2.2 ki-67抗原分析

2.2.1 ki-67抗原特點

該抗原首先從淋巴瘤L428細胞系中發現，1983年，由Gerdes 等人[10]在增殖細胞中對Ki-67抗原進行鑒定，表明Ki-67抗原是一種與核糖體RNA轉錄相關非組蛋白性核蛋白(Nonhistone nucleoprotein)，該蛋白由MKI-67基因編碼，定位于人體第10號染色體上，基因全長分別為11.5 kb和12.5kb，由15個外顯子組成，ki-67蛋白組成包括兩條相對分子量分別為395 kD和345 kD的多肽鏈組成，有兩種變異體。ki-67主要維持細胞增殖，因此其Ki-67標記指數更多被應用于腫瘤細胞狀態的監測。

2.2.2 ki-67抗原與腫瘤的關聯

Ki-67抗原在增值活躍的細胞中全程均有表達，而在細胞靜止期不表達，當細胞進入周期后，開始表達于Gl期，在S期及G2期表達逐漸增加，至M期達高峰，在分裂晚期很快消失[11]；作為反映腫瘤細胞增殖活性和細胞周期進行狀況的一個重要指標，ki-67最早用于評估乳腺癌的分級與預后，后也用于神經系統腫瘤中，通過計算Ki-67指數，在腫瘤細胞中，該指數越高，提示惡性程度越高，預后越差[12]；另一方面，ki-67半衰期短，在細胞分裂結束后迅速降解，但在惡性腫瘤細胞中，因其惡性增值，導致ki-67持續表達，使其能較好的反映腫瘤的惡性程度及患者的預后。Filippella[13]等通過研究發現，ki-67可很好的預測腫瘤侵襲、復發，且將腫瘤是否發生生物學改變的陽性和陰性臨界值設定為ki-67LI(ki-67 Labling index，ki-67LI)＞2.9%，可得到較高的敏感性及特異性；且在腫瘤細胞的增殖活性評估中，當ki-67蛋白表達越高時，患者死亡風險也相應升高[14]。

2.2.3 ki-67抗原與宮頸病變的關聯

研究發現，ki-67并不直接參與宮頸癌發病的核心機制，但在對宮頸病變進行研究時，發現隨著宮頸病變程度加重，其檢出率越高。一項關于50例老年宮頸癌手術患者研究結果顯示[15]，ki-67蛋白無陰性表達，且以強陽性表達占比最高，其次為中等陽性、弱陽性，經生存函數分析后發現，ki-67蛋白高表達患者死亡風險高，預后差，該結果與多數研究基本一致[16]，結合前面所訴，提示ki-67蛋白在宮頸病變中，隨著病變程度的加重，其表達也相應增加，可應于宮頸癌病變的篩查及宮頸癌手術患者預后的評估；并且研究還顯示，其高表達可能是患者不良預后的獨立影響因素。

2.3 p16、ki-67聯合應用

在我國宮頸癌篩查中，目前主要為宮頸細胞學涂片聯合HPV-DNA篩查，兩者聯合應用部分彌補了細胞學涂片存在的高假陰性率及HPV-DNA檢測的高假陽性率等諸多問題，但在初篩后的分流中仍存在不能很好區分高低級別病變的弊端，導致患者診療過度或重視不足；而p16/ki-67雙重染色因其在宮頸癌篩查中有較好的分流作用近年來被多數學者研究。在正常細胞中，p16基因表達可以抑制細胞周期，使細胞不會出現過度分裂，而Ki-67過表達提示細胞在大量或無限增值，兩種基因過表達提示細胞完全相反的兩種生長狀態，因此，不會同時出現過表達，若p16及Ki-67基因同時過表達，強烈提示細胞周期失調已導致宮頸發生病變[17]；因此將其作為宮頸上皮細胞的生物學狀態評估指標，可部分彌補液基細胞學和HPVDNA檢測的不足；在雙重染色的發展過程中，初始是對p16表達蛋白進行單一檢測，但在應用過程中，一些研究顯示細胞學標本中p16INK4a非特異性染色太強，最高甚至可達80%以上，導致細胞是否發生病變難以區分，加之免疫化學染色本身也會出現部分假陽性及假陰性，從而限制了其臨床應用，而Ki-67在染色上雖然誤差較小，但在計算結果方面，由于檢測方法目前尚未做到標準化，不同醫療機構、不同的實驗室診斷結果的一致性、可重復性較差，也部分限制了Ki67在臨床上的進一步應用；因此，部分研究學者將目光轉向將兩者聯合應用，多項研究證實了其有效性；李萱[18]等對1002名性宮頸篩查患者研究顯示：p16/ki-67單一的篩查在特異性和敏感性方面均低于聯合篩查；還有研究指出，p16對HSIL診斷敏感度、特異度雖然較高，但對LSIL行p16單獨檢測，存在漏診現象，建議聯合Ki-67增強檢出率[19]，特別是使用p16INK4a/Ki-67雙染色細胞學(CINTEC PLUS?，羅氏診斷公司)的HPV-DNA檢測和分選最近被證明是目前較為準確的宮頸癌篩查算法[20]；歐洲一項對27349名女性行宮頸癌篩查的大型橫斷面臨床研究[21]也顯示p16/ki-67雙染檢測診斷CINII和CINIII的靈敏度均較高；而Wentzensen等人[22]對1509例HPV感染陽性的婦女進行雙重染色的效果評估中也發現：雙重染色陽性率隨著細胞學嚴重程度的增加而增加；研究還顯示p16/Ki-67雙重免疫染色可能在ASC-US和低級別鱗狀上皮內病變(LSIL)分診中有重要的預測作用[23]；p16/Ki-67雙染還可以檢測宮頸組織細胞的致癌變化，同時可進行低級別病變及以下的分診[24,25]。另一方面，細胞形態學對p16/Ki-67雙染表達無影響，且操作人員主觀經驗對雙染結果影響較小，即使無相關經驗醫師在經過培訓后也可進行閱片操作，Duan LF等[26]通過對902名女性進行宮頸癌篩查，在對實驗結果進行判讀時顯示：兩位細胞病理學醫師對p16INK4a和TCT判讀的kappa值[kappa值：即內部一致性系數(inter-rater, Coefficient of internal consistency)，是作為評價判斷的一致性程度的重要指標。當計算結果在0.81～1區域時提示幾乎完全一致]的高度符合，提示p16INK4a染色結果的判讀在宮頸病變診斷和/或篩查中可以減少被病理醫生主觀因素的影響的優勢性。美國陰道鏡及子宮頸病理協會(American Society for Coposcopy and Cervical Pathology, ASCCP)[27]將p16/ki-67雙重染色納入宮頸篩查，表明此種篩查方法有不同于其他篩查方式的優勢及研究前景，大多數研究對于此種篩查進行大量臨床實驗來證明它的有效性，但大多數的研究均為小數據研究，受地域、醫療水平等限制，所得到臨床數據并不能代表我國大概的真實情況，因此該項篩查在實際臨床中并未得到廣泛的應用，而且有部分專家認為，截至目前為止，并未發現任何聯合標記物較單獨使用p16能實質提高診斷準確率，僅僅在p16無法確定或技術上不充分的情況下，可考慮聯合應用ki-67和/或Pro Exc IHC。因此，我們需要多方面綜合的查閱大量數據進行匯總，從而得到一個更貼近真實情況的數據，進一步探索p16/Ki-67在宮頸癌篩查方面的應用價值。

3 p16/ki-67雙重染色在SIL中的應用

3.1 適應證及禁忌癥

適應證：①HSIL(CINII/III級)及良性相似病變；②可疑HSIL(CINII)或LSIL；③細胞學傾向HSIL而組織學LSIL或陰性；④HSIL鑒別診斷存在爭議；禁忌證：①形態學上明確的良性病變，明確的CINI、CINIII級宮頸鱗狀上皮內瘤變；②LSIL與宮頸良性病變的鑒別(炎癥及鱗狀上皮反應性改變)。

3.2 p16/Ki-67雙染色報告解讀

國外學者進行相關研究證實[28]，p16/Ki67雙重染色未經正規細胞學形態培訓的技術人員經過短期的閱片培訓等即可獨立完成閱片，并且準確性和重復性都較好，盡管如此，對雙染報告的解讀仍然受其他多種因素影響，如：標本染色效果、閱片者的學習能力及個人主觀因素等，其中p16/Ki67染色弱、細胞形態保存較差以及背景染色強在其中起著中起著重要作用。結果判讀如下：①陽性判讀：強而彌漫的塊狀染色，表現為連續性強的核/核+漿染色，且自基底層開始向上延伸至少達全層厚度的1/3；②陰性判讀：局灶或斑片狀核染色，僅胞漿表達，或僅有散在的單個細胞及其余表達方式；其中，連續塊狀染色需要足夠量的組織，鱗狀上皮好的方向性，染色陽性區需與形態懷疑處對應；鱗狀上皮染色彌漫陽性的延伸范圍并非必須與CIN的級別對應；以下情況：小片組織、斜切、游離漂浮的單個細胞、及其余可能導致更主觀及不同診斷醫師間分歧的情況，判斷為陽性的最低限度為：所有有疑問的細胞均強陽性，同時這些細胞形態學上已列為需與HSIL鑒別。診斷雙重染色提高診斷的準確性及不同病理醫生間的一致性：使用雙重染色可導致約1/3CINII下調至LSIL，對形態學不確定及診斷困難的宮頸病變，尤其對局灶宮頸高級別上皮內瘤變可有輔助診斷作用；結合雙染結果，SIL的診斷：①如果染色標本在形態學符合CINII或CINIII級，則p16陽性支持組織學HSIL診斷；②染色結果在形態學上是CIN1，即使p16陽性，也不能升級為組織學HSIL(CINII級)；③極少數HSIL p16為陰性表達，準確診斷必須與形態結合；④部分小片方向性差的活檢組織，即使強而彌漫的染色也可能難以評判為陽性。

4 p16/ki-67雙重染色方法在宮頸病變篩查或診斷的研究進展

4.1 在ASC-US分流中的應用

對ASC-US進行分流是p16/Ki-67雙重染色較早用于宮頸癌篩查的應用，國內外部分學者[29]通過回顧性分析400多例ASC-US病例，將HPVE6/E7mRNA和雙重染色對宮頸可疑病變分別進行分析發現，對于宮頸篩查而言，HPVE6/E7mRNA更適合用于宮頸初步篩查，宮頸發生病變初期的基因產物，相較于病毒DNA而言，更能排除一過性的病毒感染，雙重染色在ASC-US中的分流作用較為明顯，且能與宮頸CINII有高度的一致性，陳飛等[30]回顧性分析了200例液基薄層細胞學檢查(TCT) 結果為ASC-US，并行HPVE6/E7 m R NA、p16/Ki-67檢測的患者，以陰道鏡下宮頸組織活檢結果為參照標準，認為HPVE6/E7mRNA檢測可望代替HPV-DNA 成為分流ASC-US的一種有效手段，而p16/Ki67雙重染色可輔助用于ASC-US患者宮頸組織的病理診斷。Rodens等對p16INK4a免疫細胞化學染色與HC2對ASC-US和LSIL的分流能力的Meta分析其顯示對ASC-US和LSIL均有較好的分流作用。

4.2 在CIN分流中的應用

ASCCP建議將新的分級和舊的分級聯合應用，在新的分級中，CINII、CINIII級被歸類為HSIL，而在新的篩查指南中，HSIL需進一步行宮頸環形電切術或宮頸錐切術，但部分研究發現，CINII中部分為低級別病變，可消退，并不需要進一步診治，定期隨訪即可，因此p16 /Ki67雙重染色的分流作用就顯得尤為重要。Carozzi 等[31]對宮頸HPV感染的婦女進行分流研究發現，P16/ki-67染色陽性患者3年內進展為CINⅢ的風險為4.7%，而染色陰性的患者僅有0.8%發展為CINIII。另外，在一項對中國婦女中進行的大型前瞻性研究發現[32]，p16INK4a在正常組織、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌中的陽性率分別是2.7%、42.7%、75.5%、79.6%和100%(P＜0.001)，通過對CIN1的患者進行p16/ki67雙重染色發現，與染色陰性婦女相比，雙染陽性的患者兩年后進展為高級別病變的風險是8.25(95% CI：1.02-66.62)，表明p16、ki-67過表達不僅與宮頸病理級別相關，還可對低級別病變進展為高級別病變的風險進行預測。

4.3 在HPV陽性患者的分流

Calleb George Onyango[33]等進行了一項綜合性的實驗數據結果收集，對HPV陽性婦女進行進一步基于分子標志物的篩查，以宮頸活檢結果為最終篩查結果對照，發現CIN2+檢測方法的診斷性能為：SCC-Ag：敏感度78.6-81.2%，特異度74-100%。M-CSF：敏感度68-87.7%，特異度64.7-94%；VEGF：敏感度56-83.5%，特異度74.6-96%。microRNA：敏感性52.9-67.3%，特異性76.4-94.4%。p16INKA/Ki-67：敏感性50～100%，特異性39～90.4%。HPVE6/E7/mRNA：敏感度為65-100%，特異度為42.7-90.2%；DNA甲基化：敏感度為59.7-92.9%，特異度為67-98%。提示將該聯合篩查作為HPV陽性的分診方法，可以在一次檢測陽性后即轉診陰道鏡+宮頸活檢；直接接受后續的檢查和治療。Li[34]等通過對21～70 歲參加宮頸癌篩查的婦女及門診患者共計497例進行 HPV E6/E7m RNA 檢測、液基細胞學檢測(LBC)與 p16/Ki67 雙染對比分析認為，p16/Ki67雙染技術用于HPV陽性人群的分流具有優于LBC的特異性和與LBC檢測相似靈敏度的特性。Luttmer R等[35]也表明 p16/Ki -67雙染能有效提高 CIN≥III 級病變診斷敏感度、特異度，被認為是高危型HPV陽性女性分流手段。綜合以上研究不難發現，對于HPV陽性分流的應用大部分研究仍是基于HPV聯合TCT初篩為基礎的二次分流，而不是將雙重染色用于宮頸癌的初篩，該雙染在篩查中的應用仍主要用于宮頸上皮內瘤變的分流[36]。

4.4 在宮頸癌治療和評估的應用

近十年對于p16/Ki67雙染的研究，主要是將該篩查用于ASCUS的診斷分流，但隨著后續研究，發現該染色在宮頸病變CINII及宮頸癌預后評估中也發揮重要作用。徐又先等在關于宮頸癌的研究中將ki-67與hmsh2聯合應用于宮頸癌預后表達的研究，結果表明，在宮頸癌組織中，ki-67的陽性率顯著升高，且hM-SH2在Ki-67高度表達者陽性率顯著高于Ki-67中度表達者，提示hM-SH2與 Ki-67表達的相關性，hMSH 2陽性表達伴有Ki-67過表達者，其癌細胞增殖活躍，更易發生侵襲轉移。雖然根據此研究結果我們并不能看出ki-67在宮頸癌中的具體機制及與hMSH 2相關聯程度，但其在宮頸癌的篩查及預后評估中應用價值卻值得我們進一步研究，而與p16的聯合應用，將使它的應用價值又進一步增加。GuanFY等[37]最新研究，將P16/ki-67雙重染色和HPV E6/E7 mRNA檢測及其聯合應用在低級別鱗狀上皮內病變細胞學分流診斷中的價值中發現，該雙重染色還可應用于宮頸癌治療效果及預后的評估指標。

5 展望

子宮頸癌作為最常見的婦科惡性腫瘤之一，其致病機制是一個多因素、多步驟、多階段、多種癌基因和抑癌基因參與的復雜病理過程，目前病因較為明確，且通過三階梯篩查可檢測出宮頸癌前病變。但在宮頸上皮內瘤變轉歸的評估中，一個最重要的問題就是預測病變是否有進一步轉化惡性的高危風險，以避免不必要的陰道鏡轉診，并降低醫療保健成本。目前各種基于HR-HPV的篩查項目考慮的方法多種多樣，證明了圍繞最佳分診測試缺乏共識，而積極尋找最佳的篩查和診斷方法，是我們應該積極探索和追求的。p16/ki67雙重染色包括細胞學染色及組織學染色，目前主要在宮頸病變分流中被應用，前者包括對ASCUS及HPV陽性的分流，后者則對陰道鏡活檢后對CIN病變分級不確定的患者進行分流，在臨床實際中，雙重染色的應用雖已有許多臨床數據表明其有效性，但在臨床實際應用中仍然缺乏廣泛認可，染色的應用范圍及普及性仍不確切，需要更多的臨床隨機對照研究來證明其實用性，且部分研究還顯示其在宮頸癌治療及預后評估方面也有一定指示作用，因此研究p16/ki-67雙重染色檢測，可以為宮頸癌預測和評估提供更加確切的實驗依據。