過表達miR-203對膿毒癥急性腎損傷大鼠的保護作用

李啟成，虞大為，宗靜，朱江磊，徐東升，王忠祥，王詩波

解放軍聯勤保障部隊第904醫院 a.急診科；b.消化內科；江蘇 無錫 214100

膿毒癥是指由感染引起的全身性炎癥反應綜合征，可累及多個系統和器官，進而導致患者死亡[1]。其中，膿毒癥引起的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是嚴重的并發癥之一，病死率高[2-3]。研究表明，AKI的早期發現及治療可減少患者的死亡[4]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是長度約22個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA[5]，研究證實其影響人體內關鍵代謝途徑[6]、病理進程[7]，進而在細胞增殖、分化、凋亡及應激反應[8]等方面發揮重要作用。miR-203在不同的器官組織、腫瘤中具有差異性表達，例如膀胱癌[9]、胃癌[10]、大腸癌[11]、肺癌[12]、乳腺癌[13]等，但目前鮮有報道miR-203的異常表達與膿毒癥大鼠急性腎損傷間的關系。本研究將探討miR-203對膿毒癥大鼠急性腎損傷的保護作用，以期為臨床早期干預膿毒癥急性腎損傷提供相應的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

健康的SPF級雄性成年SD大鼠購自河南省實驗動物中心[動物生產許可證號：SCXK（豫）2014-0002]，體重200±50 g，于SPF級實驗室用無菌水和飼料飼養1周后進行造模處理。

Keygen Trans新型轉染試劑購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；miRNA qRT-PCR檢測試劑盒、cDNA合成試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；改良HE染色試劑盒、高效RIPA裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；miR-203 agomir、agomir-NC由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成；大鼠肌酐（Cr）ELISA定量檢測試劑盒、大鼠尿素氮（BUN）ELISA試劑盒、大鼠腎損傷分子1（KIM-1）ELISA試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；大鼠中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）ELISA試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司；大鼠白介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒購自安徽經科生物技術有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；β-actin抗體（ab6276，小鼠單克隆抗體）、Toll樣受體4（TLR4）抗體（兔多克隆抗體）、磷酸化p65（p-p65）抗體（兔多克隆抗體）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）購自艾博抗（上海）貿易有限公司；磷酸化NF-κB（p-IκBα）抗體（小鼠單克隆抗體）購自美國圣克魯斯生物技術公司。

1.2 實驗分組及建模

將40只SPF級雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、miR-203 agomir組、agomir-NC組，每組10只，通過盲腸結扎穿刺法（CLP）建立膿毒癥大鼠模型。miR-203agomir、agomir-NC組模型建立后分別尾靜脈注射miR-203 agomir和agomir-NC，每次10 nmol/L，模型組和假手術組注射等量的生理鹽水，24 h后檢測相關指標變化情況。

1.3 RT-qPCR檢測miR-203表達水平

提取大鼠腎組織總RNA，反轉錄為cDNA，RT-qPCR測定miR-203表達水平，U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算其相對表達。miR-203正向引物為5′-ACACTCCAGCTGGGGTGAAATGTTTA-3′，反向引物為 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6 正向引物為 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應條件：95℃預變性 15 min，然后按 95℃ 5 s、60℃ 30 s進行35個循環擴增。

1.4 ELISA檢測血清腎功能指標、腎損傷指標、炎性指標

收集全血標本，4℃、1000 r/min離心20 min，收集上清。將ELISA檢測試劑盒于室溫條件下平衡20 min，標準孔中加入不同濃度的標準品50 μL，樣本孔中加入待測樣本50 μL；每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37℃孵育60 min；棄上清，加入350 μL洗滌液，室溫孵育1 min；棄上清，上述步驟重復5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入50 μL終止液，用酶標儀測定各孔的D450nm值。

1.5 HE染色觀察各組大鼠腎組織病理變化

SD大鼠造模成功24 h后麻醉處死。取腎組織，4%多聚甲醛固定后進行梯度無水乙醇脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，用蘇木精-伊紅溶液染色，脫水，中性樹脂封片。光學顯微鏡觀察大鼠腎組織的病理變化。

1.6 Western印跡檢測蛋白表達水平

組織勻漿后用RIPA裂解液提取各標本的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠進行SDS-PAGE。轉PVDF膜后加入5%脫脂牛奶進行封閉，然后加入一抗（1∶1000），4℃過夜孵育；加入二抗（1∶3000），室溫孵育1 h；洗膜后用ECL發光液顯影，采用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

1.7 統計學分析

采用SPSS 20.0醫學統計學軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組數據之間比較采用F檢驗，組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠miR-203表達水平

與假手術組比，模型組和agomir-NC組大鼠腎組織miR-203表達水平顯著下降（P＜0.05）；與agomir-NC組比，miR-203 agomir組大鼠腎組織miR-203表達水平顯著升高（P＜0.05），提示轉染成功（圖1）。

2.2 各組大鼠血清中腎功能及腎損傷標志物含量

與假手術組比，模型組和agomir-NC組大鼠血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1含量均顯著升高（F值依次為36.249、124.320、38.819、260.307，P＜0.05）；與agomir-NC組比，miR-203 agomir組大鼠血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1含量均顯著下降（t值依次為5.650、8.559、7.498、16.797，P＜0.05）（圖2）。

2.3 各組大鼠血清炎性因子含量

與假手術組比，模型組和agomir-NC組大鼠血清TNF-α、IL-1β含量均顯著升高（F值分別為248.561、91.946，P＜0.05）；與agomir-NC組比，miR-203 agomir組大鼠TNF-α、IL-1β含量均顯著下降（t值分別為16.926、7.516，P＜0.05）（圖3）。

2.4 各組大鼠腎組織病理變化

假手術組大鼠腎組織結構正常；模型組和agomir組大鼠腎組織細胞水腫，伴有炎性浸潤、腎小球皺縮、腎小管閉塞；miR-203 agomir組大鼠腎組織水腫、炎性浸潤以及腎小球和腎小管病變情況均得到緩解（圖4）。

2.5 miR-203對TLR4/NF-κB信號通路的影響

與假手術組比，模型組和agomir-NC組大鼠腎組織 TLR4、p-p65、p-IκBα蛋白表達水平顯著升 高（P＜0.05）；與 agomir-NC 組 比 ，miR-203 agomir組大鼠腎組織TLR4、p-p65、p-IκBα蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05）（圖5）。

圖1 各組大鼠miR-203表達水平

圖2 各組大鼠血清中腎功能及腎損傷標志物含量

3 討論

圖3 各組大鼠血清炎性因子含量

30%～50%膿毒癥患者會發生膿毒癥急性腎損傷，這是常見的并發癥之一，具有病情危重、臨床治療不佳、致死率高等特征[14]。已有研究表明，異常表達的miR-203在多種類型的癌癥中扮演著抑癌的角色。Shen等[9]發現miR-203可能通過負調控組織轉錄因子Twist同系物1（Twist1）而在膀胱癌細胞中充當腫瘤抑制性miRNA。Du等[11]研究表明miR-203通過靶向重組人帕金森病蛋白7（DJ-1，PARK7）抑制大腸癌細胞的增殖并促進細胞凋亡。Chen等[15]發現miR-203通過靶向脂肪酸結合蛋白4（FABP4）抑制肺癌細胞轉移。本研究通過RT-qPCR檢測各組大鼠腎組織miR-203表達水平，發現與假手術組比，模型組和agomir-NC組大鼠腎組織miR-203表達水平顯著下降；與agomir-NC組比，miR-203 agomir組大鼠腎組織miR-203表達水平顯著升高。這提示miR-203在膿毒癥急性腎損傷發生發展中扮演著抑癌作用。

HE染色結果顯示，與假手術組比，模型組和agomir-NC組大鼠腎組織細胞水腫，且伴有炎性浸潤、腎小球皺縮；過表達miR-203后，腎組織水腫、炎性浸潤及腎小球皺縮均得到顯著改善。Cr和BUN是判斷腎功能損害的重要指標，在急性腎損傷中高表達[16]；KIM-1和NGAL是急性腎損傷的重要生物標志物，在急性腎損傷早期高表達[17]。Han等[18]研究表明虎杖和肉桂通過降低Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平并抑制肝黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）表達進而改善高尿酸血癥大鼠生物腎臟功能。通過ELISA實驗觀察各組大鼠腎功能指標Cr與BUN的變化，結果顯示，與假手術組比，模型組和agomir-NC組血清Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平均顯著升高；過表達miR-203后，血清 Cr、BUN、NGAL、KIM-1水平均顯著下降。這提示miR-203能夠降低膿毒癥急性腎損傷的腎功能損害程度。

圖4 各組大鼠腎組織病理變化（200×）

圖5 miR-203對TLR4/NF-κB信號通路的影響

IL-1β和TNF-α是膿毒癥級聯反應中單核巨噬細胞產生的重要炎性因子，是反映機體炎癥程度的指標[19]。本研究結果顯示，與假手術組比，血清IL-1β、TNF-α水平均顯著升高；過表達miR-203后，血清IL-1β、TNF-α水平均顯著下降。這提示miR-203可能通過抑制炎癥反應而發揮腎臟保護作用。

王彬等[20]研究表明，在實驗性重度急性胰腺炎組織中的TLR4、NF-κB p65表達變化與腎損傷嚴重程度和促炎因子的變化一致。Zhang等[21]研究表明Tec激酶的負調控通過TLR4/NF-κB信號通路減輕脂多糖誘導的小鼠急性腎臟損傷。Zhang等[22]發現棕櫚酸通過激活 TLR4/Krüppel樣轉錄因子（KLF7）/NF-κB炎性信號促進炎性細胞因子IL-6的表達。Li等[23]研究表明紅景天苷通過抑制TLR4/NF-κB和MAPK信號通路，并減少炎性細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放，進而改善腎間質纖維化。李登等[24]研究表明miR-203通過下調TLR4-Myd88-NF-κB信號通路誘導M2型巨噬細胞極化。本研究結果顯示，與假手術組比，模型組和agomir-NC組腎組織TLR4、p-p65、p-IκBα水平均顯著升高；過表達miR-203后，腎組織 TLR4、p-p65、p-IκBα水平均顯著下降。這提示miR-203對膿毒癥急性腎損傷的保護作用是通過抑制TLR4/NF-κB信號通路起作用的。

綜上所述，本研究表明miR-203在膿毒癥急性腎損傷的發生及發展中發揮一定的作用，miR-203在其中呈低表達水平，miR-203能夠抑制炎癥反應，對膿毒癥急性腎損傷大鼠起到保護作用，其機制可能與miR-203抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。miR-203可作為膿毒癥急性腎損傷中的預測性生物標志物，對臨床診斷及療效判定等方面具有重要的意義。