竹紅菌素-聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸) 納米纖維的制備及其光敏抗菌性能

2021-01-05 02:28:20王婷婷曹秀明王清清

紡織學報 2020年5期

王婷婷，劉梁，曹秀明，王清清，

(1. 生態紡織教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇無錫 214122； 2. 江蘇陽光股份有限公司，江蘇無錫 214400)

抗生素在全球范圍內的濫用，使金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等細菌對抗生素表現出越來越強的耐藥性[1-2]，因此，近年來關于新型抗菌方法的研究受到廣泛關注。光動力抗菌化學療法(PACT)[3]具有廣譜抗菌性，且不會導致細菌產生抗藥性的特點，其原理是在可見光照射下，光敏劑在有氧條件下產生具有細胞毒性的活性氧物質來使微生物失活。相較于傳統抗菌方法，該療法所使用的光敏劑毒副作用低，在有效殺滅微生物的同時，不會使其產生抗性，且抗菌(包括細菌、真菌及病毒在內的多種微生物)范圍廣，具有良好的研究前景[4]。常見的光敏劑有卟啉類光敏劑、陽離子型光敏劑、酞菁類光敏劑、玫瑰紅等[5]。

竹紅菌素(Hc)是從竹紅菌中提取的天然光敏劑，其組分主要有2種，竹紅菌甲素和竹紅菌乙素[6-7]。竹紅菌素具有原料易得，提純過程簡單，三重態和單重態氧量子產率高，光毒性高而暗毒性低，體內清除速度快等優點[8],是一種前景較好的天然光敏劑，市售的云南白藥集團生產的竹紅菌素軟膏目前已用于治療多種皮膚病。光敏劑在固體材料上的固定為其使用提供了便利，目前，關于光敏劑竹紅菌素的固定化已有大量研究，如固定在脂質體[9-10]、納米顆粒[11-13]等材料上，但對其在靜電紡納米纖維材料上的固定化及其抗菌性能評價方面的研究并不多。

靜電紡納米纖維具有比表面積髙、纖維直徑細，吸附性好等優異性能，其所用原料來源廣泛，具有良好的可加工性，且在一定程度上對抗菌效率有提高作用[14-15]，故竹紅菌素在靜電紡絲膜上的負載具有較好的研究意義。本文采用靜電紡絲法制備含竹紅菌素的聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸)(P(MMA-co-MAA))納米纖維膜(Hc-PM)，并對納米纖維的形態、表面微觀結構、熱穩定性、單線態氧的產生以及底物氧化性能進行研究，最后評價了該材料對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的光敏抗菌效果。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

材料：聚(甲基丙烯酸甲酯-co-甲基丙烯酸)[16]，實驗室自制；竹紅菌素，江南大學生物工程學院；三氯甲烷(CHCl3，分析純)、二甲基甲酰胺(DMF，色譜純)、碘化鉀(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)、重水(D2O)，上海維塔化學試劑有限公司；金黃色葡萄球菌(ATCC-6538)及大腸桿菌(8099)，上海協久生物科技有限公司。

儀器：靜電紡絲裝置，實驗室自制；UH4150型紫外-可見-近紅外分光光度計、SU1510型掃描電子顯微鏡(SEM)，日本日立株式會社；UV-2600型紫外-可見分光光度計，日本島津制作所；DCAT-21型表-界面張力儀，德國Dataphysics公司；NICOLET IS10型傅里葉變換紅外光譜儀，中國賽默飛世爾科技有限公司；Q500型熱重分析儀，美國TA公司；XQ500 W型可調型氙燈電源，上海藍晨電子有限公司；EMX plus-10/12型電子順磁共振波譜儀，德國布魯克科技有限公司；BSP-150型生化培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 紡絲溶液的制備

紡絲液溶質P(MMA-co-MAA)質量分數為6%，質量為2 g，溶劑DMF與CHCl3的質量比為3∶7，二者混合后分別添加質量分數為0.0%、0.1%、0.3%、0.5%的光敏劑竹紅菌素，避光置于磁力攪拌器上常溫攪拌10 h至完全溶解得到紡絲液。

1.3 納米纖維膜的制備

將紡絲液倒入表面覆有錫紙的規格為20 mL的注射器中，并安裝在注射泵上，在針頭上加上正電勢使紡絲液表面帶正電荷。在高壓靜電場作用下通過靜電紡絲機進行紡絲，紡絲液所受電場力克服溶液表面張力后，噴射出帶電射流，隨著溶劑的揮發，固化為纖維隨機排布于收集裝置上[17]。靜電紡絲工藝條件為：室溫，避光，紡絲電壓19 kV，注射泵控制溶液流速1 mL/h，紡絲接收距離15 cm，用覆有錫紙的滾筒作為接收裝置。通過實驗分別紡得不含竹紅菌素的PM膜及不同質量分數Hc-PM納米纖維膜。

1.4 測試與表征

1.4.1 形貌觀察及親疏水性測試

將制得的納米纖維膜真空干燥后粘貼在樣品臺上，為降低其表面放電效應，進行噴金處理。用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察纖維的表面形貌和結構，掃描電壓為5 kV。

利用Acrobat測量軟件，取SEM照片中相同面積范圍內100段纖維進行測量，計算其平均直徑及標準差。

采用表-界面張力儀測試材料的靜態接觸角，對材料親疏水性進行表征，進一步分析其表面結構。

1.4.2 納米纖維膜的化學結構測試

利用紫外-可見-近紅外分光光度計對納米纖維膜進行掃描；配制濃度為0.1 mmol/L的竹紅菌素溶液，利用紫外-可見分光分度計對其進行掃描得到光譜圖，掃描波段均為350～700 nm。

采用傅里葉變換紅外光譜儀中衰減全反射紅外光譜法(ATR-FT-IR)測試分析納米纖維膜的化學結構。測試分辨率為4 cm-1，掃描次數為16，波數范圍為4 000～525 cm-1。

1.4.3 納米纖維膜的熱力學性能測試

采用熱失重分析儀(TG)對納米纖維膜的熱力學性能進行測試分析。將樣品(約6 mg)置于氧化鋁坩堝內，進行程序升溫：初始溫度為30.0 ℃，升溫速率為10.0 ℃/min，最終溫度為800.0 ℃，載氣為氮氣，其流速為40.0 mL/min。

1.4.4 單線態氧的電子順磁共振信號測試

利用電子順磁共振波譜儀探測納米纖維膜經光照后是否有單線態氧生成。將Hc-PM納米纖維膜置于溫度為60 ℃的干燥箱中，烘燥3 h，剪成2 cm×2 cm規格，隨后將其分別加入含有14 μmol TEMP的3 mL氧飽和D2O溶液中，在可見光(光強為65 mW/cm2，波長為420～780 nm)條件下照射1 h；然后將所得溶液轉移到石英毛細管中，固定在波譜儀的諧振腔中測試得到樣品的電子順磁共振(EPR)信號波譜。測試條件為：在0.335 T的中心場和0.007 T的掃頻寬度的磁場下操作，微波頻率9.17 GHz，功率10 mW，信號通道的掃描時間0.128 s。

1.4.5 納米纖維膜的氧化性能

通過底物KI溶液在光照條件下的吸光度變化來判斷樣品的氧化能力。將PM及Hc-PM納米纖維膜置于溫度為60 ℃的干燥箱中，烘燥3 h，并剪成1 cm×1 cm規格，分別置于20 mL濃度為0.1 mol/L的 KI溶液中，在可見光(光強為65 mW/cm2，波長為420～780 nm)照射下，每隔5 min用紫外可見分光光度計測量1次溶液吸光度。

1.4.6 光動力抗菌性能評價

參考AATCC 100—2012《抗菌紡織品的評價方法》對Hc-PM納米纖維膜進行抗菌性能評價。

將干燥的PM以及Hc-PM纖維膜分別裁為若干個形狀、厚度均一的圓形試樣，置于24孔板內。取0.1 mL濃度為1～3×108CFU/mL的菌液(PBS緩沖液)接種于各樣品上，將各組樣品分別置于光照(光強為65 mW/cm2，波長為420～780 nm)及暗室條件中培養30 min后，取0.9 mL的PBS緩沖液于24孔板中，振蕩搖勻后，取0.1 mL原菌液及試樣上的菌液，加入0.9 mL PBS緩沖液，依次等梯度稀釋1×106倍。分別從各稀釋梯度的溶液中取10 μL滴在培養基平板上，置于恒溫培養箱(37 ℃)中培養24 h。最后記錄其菌落數計算抑菌率S。

式中：N0為原菌液可計數列的菌落最大值；Ni為試樣抗菌后與原菌液對應梯度下的菌落值。

2 結果與討論

2.1 形貌及親疏水性分析

竹紅菌素質量分數分別為0.0%、0.1%、0.3%、0.5%的納米纖維膜的掃描電鏡照片如圖1所示，通過Acrobat軟件測量納米纖維的直徑如表1所示。

圖1 不同Hc質量分數的納米纖維膜的 SEM照片(×5 000)Fig.1 SEM images of nanofibrous membranes with different Hc concentrations(×5 000)

表1 PM和Hc-PM納米纖維膜的直徑分布Tab.1 Diameters of PM and Hc-PM nanofibrous membrances

由圖1和表1可知，PM膜中納米纖維直徑粗細均勻，表面光潔，隨機取向分布形成精細的三維網狀結構；添加竹紅菌素后，Hc-PM膜中納米纖維粗細不勻程度增加，纖維表面有粗節，這是因為竹紅菌素為脂溶性有機分子，在含極性溶劑DMF的紡絲液中易自發聚集[18]。隨著竹紅菌素質量分數的增加，Hc-PM納米纖維的平均直徑越來越粗，纖維間略有黏連，這是由于脂溶性竹紅菌素添加后紡絲液的濃度、黏度增加，電導率下降，紡絲液在靜電場中所受到的牽伸力降低的緣故[19]。相較之下，Hc-PM中納米纖維的橫截面比PM中納米纖維不規則，且直徑不勻度也較高。

材料本身的性質，表面形態及直徑分布對其親疏水性會產生一定影響。經靜態水接觸角測試可知，PM及Hc質量分數為0.5%的Hc-PM納米纖維膜的接觸角分別為109.2°和131.4°，均表現為疏水性。由于竹紅菌素具有疏水性，故添加了竹紅菌素的Hc-PM膜的疏水性更佳[20]。另外，對于疏水性材料，表面較大的粗糙度有利于其截留更多的空氣，從而增大接觸角[21]。總體來說，Hc-PM納米纖維更不規則，直徑不勻度更高，表面粗糙度更大，故Hc-PM膜接觸角更大，疏水性更好。

2.2 化學結構分析

通過紫外光譜及紅外光譜探究竹紅菌素于纖維膜上的負載方式，結果分別如圖2、3所示。圖中Hc-PM納米纖維膜的Hc質量分數為0.5%。

圖2 竹紅菌素溶液和納米纖維膜的紫外光譜圖Fig.2 UV-vis spectra of Hc solution and nanofibrous membranes

圖3 PM和Hc-PM納米纖維膜的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR of PM and Hc-PM nanofibrous membranes

天然光敏劑竹紅菌素主要有2種組分：竹紅菌甲素和竹紅菌乙素，其中95%以上為竹紅菌甲素，本文實驗所用竹紅菌素為混合物。由圖2可知，PM膜在350～700 nm波段無特征峰，Hc溶液有3個竹紅菌素的典型特征峰，分別為468.5、528.0和571.0 nm；同樣地，Hc-PM也有3個特征峰，分別為465.0、530.0和571.0 nm，與Hc溶液相符。這說明Hc-PM膜中負載有竹紅菌素，且其化學組分沒有因靜電紡絲過程而改變。

2.3 熱力學性能分析

通過熱重分析研究PM及Hc質量分數為0.5%的Hc-PM納米纖維膜的熱學性能，結果如圖4所示。可知：在350 ℃前，納米纖維膜有較小的質量損失，主要是由于聚合物中含有的水分和小分子物質等雜質的去除，以及纖維膜側鏈基團的初步降解；在300～450 ℃范圍內，納米纖維膜骨架開始降解[7]，使其質量明顯下降，在450 ℃達到完全降解。比較2條曲線可知，竹紅菌素的加入使納米纖維膜骨架降解的初始降解溫度由302 ℃降至292 ℃，最大降解速率溫度由426 ℃降至412 ℃，降解速度稍稍變快，說明竹紅菌素的加入使得纖維膜的熱穩定性下降，但影響較小。

圖4 PM和Hc-PM膜的熱穩定性曲線Fig.4 TG(a)and DTG(b)curves of PM and Hc-PM nanofibrous membranes

2.4 單線態氧的電子順磁共振信號分析

光敏劑竹紅菌素經光照后躍遷至激發態，將分子氧轉化為具有高反應活性、高氧化性的單線態氧(1O2)。由于1O2的壽命較短，因此，可用捕獲劑2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(TEMP)捕獲1O2生成2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮-N-氧化物自由基(TEMPO)，通過檢測TEMPO的電子順磁共振(EPR)信號來判斷是否有1O2生成[22]。Hc質量分數為0.5%的Hc-PM膜經光照后產生的EPR信號如圖5所示。

圖5 光照Hc-PM膜與TEMP生成的TEMPO的EPR信號Fig.5 EPR signal of TEMPO generated by Hc-PM membrane and TEMP after illumination

由圖5可知，純D2O空白樣無信號，而Hc-PM膜呈現出典型的氮氧自由基的三重峰，證明了1O2的存在。說明竹紅菌素的負載使得Hc-PM膜經光照后能將O2轉化為1O2，發揮其光敏效能。

2.5 氧化性能分析

竹紅菌素經光照后產生1O2，利用1O2對I-的氧化作用進行氧化性能分析[23]。圖6示出Hc質量分數為0.5%的Hc-PM納米纖維膜在持續光照條件下，溶液紫外吸收變化的光譜圖。可知，在1O2的氧化作用下，I-被氧化為I3-，且I3-的濃度正比于1O2的濃度[24]。隨著I3-的濃度上升，溶液呈淡黃色，在紫外光譜的287和351 nm處出現其特征峰，后文選取351 nm作為測定波長。

圖6 Hc-PM納米纖維膜的KI溶液紫外吸收光譜Fig.6 UV-Vis absorption spectra of KI solution photooxidized by Hc-PM nanofibrous membrane

圖7為PM和Hc質量分數為0.5%的Hc-PM膜隨光照時長的增加，在351 nm處吸光度的變化圖。可知：PM膜經可見光照射后，吸收值有較小上升趨勢，說明PM膜和KI在空氣中能發生少量的氧化反應；而添加了竹紅菌素的Hc-PM膜經光照后，351 nm處吸收值顯著增加，說明其具有良好的光動力氧化性能。

圖7 PM和Hc-PM膜在351 nm處的KI溶液紫外吸收圖Fig.7 UV-Vis absorbance of KI solution at 351 nm photooxidized by PM and Hc-PM nanofibrous membranes

為進一步證明竹紅菌素的添加賦予了PM膜氧化能力，檢測竹紅菌素質量分數為0.1%和0.3%的Hc-PM膜底物的氧化能力，結果如圖8所示。可知，隨著竹紅菌素質量分數的增加，Hc-PM納米纖維膜的氧化能力有所提高。

2.6 光動力抗菌性能分析

表2示出PM和竹紅菌素質量分數為0.5%的Hc-PM膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率測試結果。可知，PM膜無論是在光照條件，還是暗室條件下，對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌均無明顯抗菌效果。Hc-PM膜在光照條件下，對金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌效果，抑菌率約為99.97%；但對大腸桿菌的抗菌效果不佳，抑菌率約為54.41%。主要原因有2個：一是竹紅菌素本身對革蘭氏陰性菌不敏感[6]；二是革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的結構不同，屬于革蘭氏陽性菌的金黃色葡萄球菌外膜成分主要為肽聚糖，其疏松多孔的結構易被光敏劑分子及活性氧物質穿透，而屬于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌的外膜在肽聚糖的基礎上，還有脂多糖、脂質雙層和脂蛋白，結構較為密實，因而能有效阻止一部分光敏劑分子及活性氧物質穿透其結構并對其產生光敏抗菌效果[25]，因此，Hc-PM膜對大腸桿菌的抗菌效果不如金黃色葡萄球菌。