基于指紋圖譜與多元統計分析的梔子不同炮制品評價

黃躍前，程學仁，吳文平，朱德全，黃敏燁，楊曉東，羅宇琴，何廣銘

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

梔子為傳統藥食兩用資源，始載于《神農本草經》[1]。據2015年版《中國藥典》收載，梔子為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實[2]，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，外用可消腫止痛，用于熱病心煩、濕熱黃疸、淋證澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡瘍；外治扭挫傷痛。每年9～11月對果實成熟呈紅黃色時的梔子進行采收，除去果梗和雜質，蒸至上氣或置沸水中略燙，取出，干燥。因梔子性味苦寒，容易對脾胃造成損傷，脾胃較弱者服后易吐，炒制后能降低這種弊端造成的傷害[3-5]，自漢代以來非常重視對梔子的炮制處理[6]。現代常見的梔子炮制方法有清炒法(炒黃、炒焦、炒炭)、酒制法和姜制法等[7]，2015年版《中國藥典》收錄的炮制品有炒梔子與焦梔子[2]，炒梔子與焦梔子均以梔子照清炒法炮制，二者炒制程度不一樣；炒梔子藥效與梔子相近，而焦梔子涼血止血，并有較強的鎮靜和凝血作用。2015年版《中國藥典》僅對梔子、炒梔子與焦梔子的梔子苷含量進行限定，不能全面反映梔子、炒梔子與焦梔子飲片的質量。

本研究擬建立《中國藥典》2015年版收錄的梔子炮制品(梔子、炒梔子、焦梔子)的指紋圖譜方法，結合中藥指紋圖譜相似度評價系統與SIMCA-P對3者進行相似度評價及多元統計分析，找出各炮制品的差異組分，為梔子不同炮制品質量標準的建立及質量標志物的選擇提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色譜柱；XP26型百萬分之一分析天平、ME204E型萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ500D型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(美國默克股份有限公司)。

1.2 試藥

梔子苷(批號110749-201718，質量分數97.6%)、西紅花苷-Ⅰ(批號111588-201303，質量分數92.6%)、西紅花苷-Ⅱ(批號111589-201705，質量分數92.2%)對照品均由中國食品藥品檢定研究院提供；京尼平龍膽雙糖苷(批號16120502，質量分數98.98%)由成都普菲德有限公司提供；甲醇為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。

10批梔子藥材(S01～S10)經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，均為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果實，炒梔子(CS01～CS10)與焦梔子(JS01～JS10)是10批梔子藥材經炮制得到的飲片，詳細信息見表1。

表1 10批梔子藥材及其炮制品的來源信息

2 方法與結果

2.1 梔子炮制品的制備

梔子：取10批梔子原藥材，揀去雜質，碾碎。

炒梔子：取10批梔子原藥材，照清炒法(2015年版《中國藥典》四部通則0213)用文火加熱炒至黃褐色，取出，放涼，即炒梔子。

焦梔子：取10批梔子原藥材，照清炒法(2015年版《中國藥典》四部通則0213)用中火炒至表面焦褐色，果皮內表面或種子表面為黃棕色或棕褐色，取出，放涼[5]，即焦梔子。

2.2 對照品溶液的配制

分別精密稱定京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷-Ⅰ、梔子苷、西紅花苷-Ⅱ適量，加甲醇制成質量濃度為115.2、42.6、259.3、40.6 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制

取本品粉末(過四號篩)適量，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%(體積分數，下同)甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用60%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 色譜條件

YMC Triart C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)色譜柱；以乙腈為流動相A，水為流動相B，梯度洗脫(0～5 min，5%～20%A；5.01～9.5 min，26%～40%；9.5～11 min，40%～90%A；11.01～18 min，5%A)；流速為0.4 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長：0～6 min為238 nm，6～11 min為440 nm，11～18 min為238 nm。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 以同一供試品溶液按“2.4”項色譜條件連續測定6次，以峰5(梔子苷)為參照峰(S)，計算其余各共有峰的相對峰面積RSD值范圍為0.27%～0.35%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 以同一供試品溶液按“2.4”項色譜條件，分別在0、2、4、6、8、12 h后依次測定樣品，以峰5(梔子苷)為參照峰(S)，計算其余各共有峰的相對峰面積RSD值為0.16%～0.31%，表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.5.3 重復性試驗 取S04樣品6份，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定，以峰5(梔子苷)為參照峰，計算其余各共有峰的相對峰面積RSD值為0.48%～0.63%，表明方法重復性良好。

2.6 梔子、炒梔子與焦梔子指紋圖譜的建立和共有峰的標定

分別將梔子、炒梔子與焦梔子的UPLC結果的“.cdf”文件導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”(2012年版)，以中位數法，經多點校正再自動峰匹配得到3種炮制品的指紋圖譜，其疊加圖見圖1，共有模式指紋圖譜見圖2。梔子、炒梔子與焦梔子均自動匹配了7個共有峰，其中峰4、5、6、7經與對照品比較，分別確認為京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ。

分別將10批梔子、炒梔子與焦梔子的UPLC指紋圖譜與對照指紋圖譜進行相似度評價，10批梔子的相似度在0.978～0.998之間；10批炒梔子的相似度在0.983～0.998之間；10批焦梔子的相似度在0.983～1.000之間，表明梔子各種炮制品的UPLC指紋圖譜相似度較高。

圖1 梔子(A)、炒梔子(B)與焦梔子(C)UPLC指紋圖譜疊加圖

2.7 偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)

3種梔子炮制品的指紋圖譜相似度比較高，為了找出能區別不同炮制品的主要成分，取3種炮制品7個共有峰的指紋圖譜數據導入SIMCA-P 12.0軟件，采用有監督模式識別的OPLS-DA進行考察，建立3組OPLS-DA模型。3種炮制品共有峰OPLS-DA得分圖見圖3。OPLS-DA模型中，R2X(cum)與R2Y(cum)分別表示在X軸方向和Y軸方向上，主成分1和主成分2對變量的解釋能力，Q2(cum)表示模型對分組的預測能力，3者數值越趨近于 1，模型的解釋與預測能力越強[8]。梔子與炒梔子、梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子的R2X(cum)分別為0.940、0.987和0.897，R2Y(cum)分別為0.800、0.818、0.702，說明建立的3組OPLS-DA模型中的2個主成分均能有效解釋3種炮制品之間的差異；梔子與炒梔子、梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子的Q2(cum)分別為0.453、0.616和0.486，說明該模型具有一定的預測能力。

A.對照品溶液； B.梔子； C.炒梔子； D.焦梔子； 峰4.京尼平龍膽雙糖苷； 峰5.梔子苷； 峰6.西紅花苷-Ⅰ； 峰7.西紅花苷-Ⅱ。

在建立的OPLS-DA模型下，可生成共有峰相對峰面積的S-plot圖，縱坐標 P(corr)代表每個組分的相關系數，P值的絕對值越大，對分組的貢獻就越大。由圖4可見，峰4[京尼平龍膽雙糖苷，P(corr)=0.392]和峰6[西紅花苷-Ι，P(corr)=0.302]對梔子與炒梔子分組貢獻最大；峰6[西紅花苷-Ι，P(corr)=0.809]和峰7[西紅花苷-Ⅱ，P(corr)=0.608]對梔子與焦梔子分組貢獻最大；峰6[西紅花苷-Ι，P(corr)=0.708]、峰7[西紅花苷-Ⅱ，P(corr)=0.547]和峰3[P(corr)=0.453]對炒梔子與焦梔子分組貢獻最大。

圖3 梔子與焦梔子(A)、梔子與炒梔子(B)、炒梔子與焦梔子(C)的OPLS-DA得分圖

使用變量權重值(variable importance inprojection，VIP)也可以篩選出對組間分類貢獻最大的組分。從圖5可見，峰6(西紅花苷-Ⅰ)對梔子與炒梔子、梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子的分組均有貢獻，VIP值分別為1.367、1.851、1.674；峰7(西紅花苷-Ⅱ)對梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子的分組有貢獻，VIP值分別為1.379、1.303；峰4(京尼平龍膽雙糖苷)對梔子與炒梔子的分組有貢獻，VIP值為1.807。篩選出來的有貢獻差異組分與S-plot得分圖所得結果一致。

A.梔子與炒梔子；B.梔子與焦梔子；C.炒梔子與焦梔子。

3 討論

本研究建立了梔子、炒梔子與焦梔子的UPLC指紋圖譜，3個指紋圖譜均標識出了7個共有峰，其中峰4、5、6、7分別為京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ。梔子指紋圖譜的相似度在0.978以上，炒梔子指紋圖譜的相似度在0.983以上，焦梔子指紋圖譜的相似度在0.983以上。

A.梔子與炒梔子；B.梔子與焦梔子；C.炒梔子與焦梔子。

OPLS-DA分析可知，西紅花苷-Ⅰ在梔子與炒梔子、梔子與焦梔子、炒梔子與焦梔子均存在明顯差異，對區分3者貢獻最大。這可能與梔子在炒制過程中所用的火候有關，炒梔子所用的是文火，焦梔所用的是中火，不同的炒制溫度造成生品、炒黃品與炒焦品之間的差異。杜偉峰等[9]比較不同產地及其炮制品中綠原酸、梔子苷和西紅花苷-Ⅰ的量，發現不同產地的梔子經炮制后3種成分的量均顯著下降，焦梔子中各成分的量較炒梔子更低，在炒梔子與焦梔子中均檢測不到西紅花苷-Ⅰ，可能是由于清炒以及炒焦時的高熱量導致這3種成分降解，焦梔子中西紅花苷-Ⅰ含量最低是由于其受熱的溫度和時間均大于炒梔子。付小梅等[10]在西紅花苷-I的穩定性研究中發現西紅花苷-Ⅰ對溫度敏感，隨著溫度的升高其半衰期縮短。西紅花苷-Ⅰ是梔子黃色素的主要成分[12]，具有利膽、抗感染、抗氧化、抗腫瘤等作用[11-13]。2015年版《中國藥典》中梔子與炒梔子均屬于梔子的飲片，功效相同，均有抗感染、利膽等作用，而焦梔子僅保留涼血止血的功效[2]，這可能與其西紅花苷-Ⅰ的含量偏低有關。李水清等[14]認為梔子生用善于清熱瀉火、涼血，而炒焦之后其收斂之性增強，增加了止血的功效。

本研究所建立的梔子不同炮制品的UPLC指紋圖譜，能有效體現梔子不同炮制品作用差異，可為梔子不同炮制品的質量標準提升提供一定的參考價值。