基于自噬基因mRNA-microRNA研究白楊素抑制LPS所致RAW264.7細胞炎癥的機制

胡子旋，蔡大可，李鈺婷1,，黃雪君，甘海寧，黃丹娥，姚楠，陳玉興*

(1. 廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東 廣州 510405； 2.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東 廣州 510095； 3.廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州 510095)

炎癥是機體抵御生理應激的基本防御機制，常見于組織創傷、感染性或缺血性疾病以及代謝紊亂、自身免疫應激等各種疾病過程中[1-2]。適度的炎癥可以清除損傷組織，啟動防御性愈合，恢復機體內穩態，但過強的炎癥反應也會引起機體損傷，加重疾病過程[3-4]。白楊素是黃酮類化合物中最具生物活性的成分之一，有文獻表明白楊素具有較強的抗炎、抗氧化等藥理活性[1,5]，其抗炎機制與消除細胞中的活性氧及調控NF-κB通路有關[6]，但是白楊素的抗炎作用是否與其調控自噬過程相關，未見報道。

自噬是真核細胞中的一種高度保守的分解代謝過程，其在能量匱乏時重新利用細胞內成分獲取能量，在應激條件下吞噬有害蛋白和細胞器，形成一種對抗細胞內病原體的重要防御機制[7-8]。有文獻報道了自噬作為細胞保護方式參與機體免疫和炎癥調控的機制[9]，有利于成為拓展開發抗炎藥物的新靶點。microRNA是一種轉錄后調節因子，可以通過靶向調控mRNA的轉錄進而調節自噬過程的不同階段[8]，在疾病的預防與治療中發揮著重要作用。本研究著重評估自噬以及自噬相關microRNA與白楊素抗炎作用的相關性，為深入探索白楊素抗炎作用提供基因水平和表觀遺傳學方面的基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

RAW264.7小鼠巨噬細胞系購自上海中科院細胞庫。純度為98.5%的白楊素(北京壇墨質檢科技有限公司，中國，批號BW5648)；脂多糖(LPS，廣州奕元生物技術有限公司，中國，批號20200115)；二甲亞砜(DMSO，上海生工生物工程有限公司，中國，批號EB26BA0032)；MEM-alpha高糖培養基(Gibco公司，美國，批號8118414)；胎牛血清(Bovogen公司，澳大利亞，批號1909A)；Penicillin-Streptomycin Solution雙抗(上海生工生物工程有限公司，中國，批號G402FA0002)；CCK8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，中國，批號616A011)；總RNA提取試劑Trigol(北京鼎國昌盛生物技術有限公司，中國，批號NEP019-2)；RT-qPCR試劑盒(TaKaRa公司，日本，批號1904856A)；Mir-XTMmiRNA試劑盒(TaKaRa公司，日本,批號1809671A)。

1.2 主要儀器

細胞培養箱(ThermoFisher公司，美國)；Bio-RAD全自動酶標儀(ThermoFisher公司，美國)；IQ5熒光定量PCR儀(ThermoFisher公司，美國)；CKX41型倒置顯微鏡(奧林巴斯，日本)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 使用含有10%(φ)胎牛血清與1%雙抗的MEM-alpha培養基培養RAW264.7細胞。將細胞置于37 ℃、5%(φ)CO2恒溫培養箱中，每隔24 h置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3.2 細胞活性檢測 將RAW264.7細胞接種于96孔板，調節細胞濃度為104/mL孔，細胞培養箱中培養24 h。白楊素純度為98.5%，摩爾質量為254.24，稱取9.6 mg的白楊素溶于185 μL DMSO溶液中，配成200 μmol/L的白楊素溶液。將白楊素用MEM-alpha培養基稀釋成不同藥物濃度(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150、200 μmol/L)。更換細胞培養液，加入不同濃度的藥物，繼續培養24 h。加入CCK8試劑10 μL/孔，培養1 h后用酶標儀檢測在562 nm波長下各孔的A(λ)值，計算存活率。

存活率=實驗組A(λ)均值/對照組A(λ)均值×100%

1.3.3 實時定量熒光PCR檢測 將4×105/mL的RAW264.7細胞接種于6孔板，培養24 h后，更換培養液，設置空白對照組，LPS模型組(0.1 μg/mL)，LPS+白楊素高、中、低劑量組，每組設3個平行孔，繼續培養24 h。棄去上清，Trigol處理細胞樣品，提取總RNA，按照PCR試劑盒說明書操作，逆轉錄為cDNA。

將1 μL cDNA、11 μL ddH2O、0.25 μL前引物F、0.25 μL后引物R、12.5 μL SYBRGreen、0.5 μL ROX混合后，以94 ℃×5 min→94 ℃×30 s→5 ℃×30 s→72 ℃×50 s(45個循環)；72 ℃×7 min進行擴增,運用2-ΔΔCt法計算基因表達量。引物設計利用Primer 5.0生物軟件，基因的引物由上海英濰捷基公司合成，引物序列如表1所示。

1.3.4 microRNA 檢測方法 總RNA提取方法同“1.3.3”，按照microRNA試劑盒說明書操作，逆轉錄為cDNA。將2 μL cDNA、9 μL ddH2O、0.5 μL特異引物、0.5 μL通用引物Mrq3'primer、12.5 μL SYBR Green、0.5 μL ROX混合后，以95 ℃×10 s→ 95 ℃×5 s→ 60 ℃×20 s→ 95 ℃×60 s→ 55 ℃×30 s(40個循環)；60 ℃進行擴增,運用2-ΔΔCt法計算基因表達量。引物由Takara公司合成，引物序列如表2所示。

表1 擴增的基因引物信息

表2 microRNA引物序列

1.3.5 數據統計 由IBM SPSS22.0軟件進行數據統計，多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊采用SNK法，方差不齊采用DunnettT3檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白楊素對RAW264.7細胞存活率的影響

CCK8檢測不同濃度白楊素對Raw264.7細胞的毒性。結果如圖1，細胞存活率隨著白楊素濃度的升高而降低，12.5～200 μmol/L時細胞存活率低于90%，6.25 μmol/L時對RAW264.7細胞活力沒有顯著影響，可作為白楊素抗炎及機制的安全濃度范圍。因此實驗采用5、0.5、0.05 μmol/L濃度作為白楊素高、中、低劑量。

2.2 白楊素對炎癥和自噬相關基因表達水平的影響

白楊素對炎癥相關基因的影響如圖2。與空白組相比，LPS組中IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS基因表達顯著上升(P<0.05或P<0.01)，藥物干預后，IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS的表達水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)；與空白組相比，模型組IL-5、IL-10基因表達明顯下降(P<0.05)，白楊素給藥組中IL-5、IL-10有明顯上調作用(P<0.05)。

自噬相關基因表達結果如圖3。與模型組相比，白楊素組能明顯上調beclin1、ULK1、LC3B、ATG5、ATG4B基因的表達(P<0.05或P<0.01)。

圖1 白楊素對RAW264.7細胞存活率的影響

2.3 白楊素對microRNA表達的影響

自噬相關microRNA的表達結果如圖4。與空白組相比，模型組miR-26a-5p、miR-30e-5p、miR-124-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-204-5p的表達顯著上升(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，白楊素組miR-26a-5p、miR-30e-5p、miR-124-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-204-5p的表達顯著下降(P<0.05或P<0.01)，并呈現濃度依賴性。

與空白組比較：#P<0.05,##P<0.01; 與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01。

與空白組比較：#P<0.05,##P<0.01; 與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01。

與空白組比較：#P<0.05,##P<0.01; 與模型組比較：*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

巨噬細胞是一種具有較強的可塑性和異質性的細胞群體，在不同微環境下分化成具有不同生物學特性和功能的亞型，主要可分為M1和M2型。M1型巨噬細胞通過IFN-γ和脂多糖LPS活化，產生促炎因子(如IL-1β、IL-6)，引發免疫反應，同時可激活炎癥相關酶類(iNOS、COX-2)，加劇對健康有害的炎癥過程；M2型巨噬細胞通過Th2免疫應答分泌抗炎因子IL-10和TGF-β，抑制炎癥反應，減少促炎因子引起的組織損傷[10-11]。本研究結果顯示白楊素能顯著降低IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS的基因水平，抑制巨噬細胞的炎癥反應，顯示出良好的抗炎活性。同時白楊素能上調抗炎因子IL-10和調節因子IL-5的表達水平，促進組織修復而減少炎癥反應，提示白楊素能夠促進RAW264.7細胞向M2轉化。結果中白楊素調控IL-5、IL-10等炎癥因子不呈現劑量相關性，可能由于這些炎癥因子的調控不屬于白楊素的直接靶點，是白楊素多靶點調控巨噬細胞的結果。

鑒于自噬與巨噬細胞中炎癥的調控有著密切的關系[12]，因此推測白楊素的抗炎機制與自噬相關。自噬體的形成是多種基因共同調控的結果，特別是自噬的激活以及自噬通量對于減少炎癥的損傷有關鍵意義[13]。本實驗將beclin1、ULK1、LC3B、ATG5、ATG4B作為自噬啟動的檢測指標，研究白楊素調控炎癥的分子機制。有研究表明白楊素可通過抑制mTOR從而激活自噬，發揮抗炎作用[14]。同時有報道PI3K/Akt-Beclin1通路負向調節NF-κB依賴的炎癥反應從而抑制TNF-a、IL-1β的產生[15]。本實驗中也發現白楊素發揮抗炎作用的同時上調了炎癥模型中自噬基因的表達，說明在巨噬細胞的抗炎調控中與文獻報道機制相似。在脂多糖刺激的巨噬細胞中，iNOS可與自噬受體p62相互作用并共定位，同時可與LC3部分共定位，作為自噬底物被招募到自噬體進行降解[16]。本實驗結果中LC3B表達量與iNOS表達量變化趨勢相反，本實驗結果驗證巨噬細胞通過自噬降解iNOS從而抑制炎癥反應的機制，同時提示白楊素發揮抗炎藥理作用的分子機制與自噬相關基因的mRNA水平調控密切相關。綜上所述，在LPS所致炎癥過程中，自噬相關蛋白LC3B、beclin1、ATG5、ULK1、ATG4B等在轉錄階段已經受到抑制，LPS可能抑制上述蛋白聚集而形成的自噬小體，特別是對于自噬小體囊膜構成具有重要意義的LC3B、beclin1基因[17-18]，也使得后續發揮降解蛋白功效的自噬溶酶體無法形成。白楊素可能通過逆轉LPS所致自噬抑制的機制而發揮抗炎作用，而自噬相關mRNA受到抑制的原因可能與調控mRNA水平的因素相關，為了進一步探索其機制，本研究從負性調控mRNA的microRNA進行了探索。

白楊素顯著調控與自噬啟動、生成相關的mRNA，而microRNA對mRNA具有負性調控作用，能夠在細胞質內降解目標mRNA[8]，于是檢測了多個自噬相關microRNA(如表3)。結果表明白楊素可下調miR-26a-5p、miR-30e-5p、miR-124-3p、miR-155-5p、miR-199a-5p、miR-204-5p表達水平，而且白楊素對于microRNA的調控呈現劑量依賴關系。有研究發現ULK1是miR-26a-5p的一個重要靶點，miR-26a-5p通過抑制ULK1的表達而抑制自噬的啟動[19]。在雙膜延伸階段，miR-124-3p能夠直接作用于beclin1而下調自噬水平，阻止吞噬泡的形成[18]。miR-204-5p能靶向調控LC3B，從而影響自噬體的形成[20]。可見多個microRNA調節著自噬過程的不同階段，研究結果中白楊素調控多個microRNA，也提示白楊素的作用機制可能是多靶點的，與多個通路相關的。本研究提示白楊素作為黃酮類成分具有多靶點調控的特點，與文獻報道有類似的地方[1]。鑒于表觀遺傳學角度探討白楊素抗炎作用的報道較少見，本研究從microRNA和mRNA關聯調控著手，為深入剖析白楊素調控的關鍵靶點提供前期基礎。

本研究從microRNA和mRNA的水平上探索了白楊素調控自噬與抑制炎癥的相關性，但確切的關聯機制及關鍵信號通路有待挖掘。

綜上所述，白楊素能有效抑制RAW264.7細胞的炎癥反應，同時白楊素發揮抗炎作用可能是調控自噬相關mRNA和microRNA共同作用的結果。

表3 microRNA對應調控的基因靶點及其功能