miR-509-3p增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性的作用及其機制

武紅，張曦輝，王軍，張占薪，雷娜

(鄭州人民醫院婦科,河南 鄭州 450003)

卵巢癌是女性生殖系統中3種主要惡性腫瘤類型之一，其臨床治療以腫瘤細胞減滅術為基礎，在紫杉醇和鉑類聯合化療的6～8個療程的輔助下，完全緩解率可達到70%～80%[1-2]，而順鉑是最廣泛使用的化學療法之一[3]。卵巢癌患者預后差和死亡率高的部分原因是他們對鉑類化學療法的反應較差，因此了解卵巢癌患者耐藥性發生和逆轉的潛在機制對于提高生存率和改善這些患者的預后具有重要的臨床意義。

microRNA可通過起抑癌基因或癌基因的作用，促進卵巢癌的發生和發展[4]。FOXM1是一種與增殖相關的促癌轉錄因子，在包括卵巢癌等多種實體腫瘤中表達增加[5]，通過轉錄激活相關基因表達可共同調控卵巢癌的發生發展。相關研究表明，高表達FOXM1可增強多種藥物的抗腫瘤作用[6]。本文旨在探究miR-509-3p通過靶向FOXM1對人卵巢癌順鉑耐藥SKOV3/DDP細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培養基(61870-127)、胎牛血清(26400-036)、青-鏈霉素(15140-122)、胰蛋白酶(25200-056)購自美國Gibco公司；LipoRNAiTM轉染試劑(C0535)、CCK-8試劑盒(C0037)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062S)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)購自上海碧云天生物技術研究所；熒光素酶(L7840)檢測試劑盒購自Solarbio公司；Anti FOXM1(ab180710)、ACTIN(ab8227)購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養

人卵巢癌細胞SKOV-3和人卵巢癌順鉑耐藥SKOV3/DDP細胞來源于美國模式培養物研究所(ATCC)，將細胞培養于RPMI1640培養基中，添加10%(φ)胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，置于37 ℃含5%CO2的培養箱中培養，每24小時更換新鮮培養基，1∶2傳代。選用對數生長期細胞為實驗用細胞。

1.3 RT-PCR

用Trizol法從SKOV-3和SKOV3/DDP細胞中提取總RNA，用Nanodrop分光光度計測定吸光度值(A260/A280)，按試劑盒說明書進行cDNA合成和PCR的擴增，反應條件為:94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴增35個循環; 72 ℃延長10 min。存儲在4 ℃條件下。反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。以ACTIN為內參，用2-△△Ct方法計算。miR-509-3p F為：5′-UGA UUGGUACGUCUGUGGGUAGTT-3′，R為：5′-CUA CCCACAGACGUACCAAUCATT-3′。FOXM1 F為：5′-GCCAACCGCTACTTGACATT-3′，R為：5′-TTG ATGGGTCTCGCTAAGTGT-3′。ACTIN F為：5′-ACT CTTCCAGCCTTCCTTCCT-3′，R為：5′-GTGATCTCC TTCTGCATCCTGT-3′。

1.4 細胞轉染及分組

將SKOV3/DDP細胞轉染miR-509-3p mimic，細胞隨機分為3組：Control組、mimic-NC組和miR-509-3p mimic組。將SKOV3細胞轉染miR-509-3p inhibitor，細胞隨機分為3組：Control組、inhibitor-NC組和miR-509-3p inhibitor組。RT-PCR檢測miR-509-3p表達。

1.5 Western blot

取各組細胞用BCA試劑盒提取總蛋白并測定蛋白質含量。提取等量的蛋白質樣品100 ℃變性5 min。用SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉移至PVDF膜，在4 ℃條件下加入相應一抗：FOXM1(1∶1000)并孵育過夜，清洗，然后在4 ℃下加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000)，孵育2 h，最后加入發光液，曝光處理。ImageJ軟件統計灰度值。

1.6 CCK-8

將SKOV3/DDP細胞和SKOV3細胞接種于96孔板(100 μL/孔)孵育24 h后，用不同劑量(0、0.5、1、2.5、5、10、25、50)DDP處理細胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，在450 nm處用酶標儀測定A值。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集各組細胞，以1×105接種于6孔板，每孔細胞懸液1 000 μL。置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養24 h后，按方法“1.4”進行處理。處理后收集細胞至1.5 mL離心管中，用預冷的PBS緩沖液洗滌3次(1 000 r/min，離心5 min)，棄上清，加入50 μL Annexin V-FITC結合液重懸細胞，再分別加入1 μL Annexin V-FITC和2 μL碘化丙啶染色液(PI)，混勻后避光孵育20 min，每支離心管加入預冷的PBS緩沖液150 μL，混勻后用流式細胞儀分析。

1.8 熒光素酶報告實驗

通過PCR擴增出含有miR-509-3p結合位點的FOXM13′UTR序列，將該序列克隆到pGL3-basic載體中, 命名為pGL3-FOXM13′UTR載體。通過基因定點誘變構建出pGL3-FOXM13′UTRmut載體，作為陰性對照，然后將pGL3-FOXM13′UTR或pGL3-FOXM13′UTRmut載體與miR-509-3p mimic或mimic NC，連同pRL-TK載體共轉染至皮層神經元細胞。轉染48 h后，收集細胞，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.9 過表達FOXM1

構建FOXM1 pcDNA載體過表達FOXM1轉染至SKOV3/DDP細胞，RT-PCR和Western blot驗證是否過表達成功。選擇SKOV3/DDP細胞轉染mimic或聯合轉染pcDNA-FOXM1將細胞隨機分為4組：Control組、miR-509-3p組、mimic+pcDNA組和mimic+FOXM1組，蛋白免疫印跡檢測FOXM1蛋白表達水平，CCK-8檢測細胞活力，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 miR-509-3p、FOXM1表達水平

通過RT-PCR檢測miR-509-3p、FOXM1在卵巢癌細胞SKOV3和順鉑耐藥細胞株SKOV3/DDP中表達情況結果如圖1所示，與SKOV3細胞比較，SKOV3/DDP細胞miR-509-3p水平顯著降低(P<0.05)，FOXM1水平顯著升高(P<0.05)。

與SKOV3細胞比較，*P<0.05

2.2 SKOV3/DDP細胞轉染miR-509-3p mimic和SKOV3細胞轉染miR-509-3p inhibitor對miR-509-3p、FOXM1表達水平及細胞存活率的影響

將SKOV3/DDP細胞轉染miR-509-3p mimic，通過RT-PCR檢測miR-509-3p、FOXM1表達水平，CCK-8法檢測細胞存活率結果如圖2ACE所示，與Control組比較，miR-509-3p mimic組miR-509-3p水平顯著升高(P<0.05)，FOXM1水平顯著降低(P<0.05)，細胞存活率顯著降低(P<0.05)；將SKOV3細胞轉染miR-509-3p inhibitor，通過RT-PCR檢測miR-509-3p、FOXM1表達水平，CCK-8法檢測細胞存活率結果如圖2所示，與Control組比較，miR-509-3p inhibitor組miR-509-3p水平顯著降低(P<0.05)，FOXM1水平顯著升高(P<0.05)，細胞存活率顯著升高(P<0.05)。

2.3 miR-509-3p對SKOV3/DDP細胞和SKOV3細胞凋亡的影響

通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況結果如圖3所示，在SKOV3/DDP細胞中，與Control組比較，miR-509-3p mimic組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；在SKOV3細胞中，與Control組比較，miR-509-3p inhibitor組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

與Control組比較，*P<0.05

與Control組比較，*P<0.05

2.4 FOXM1與miR-509-3p靶向關系

通過熒光素酶活性檢測FOXM1與miR-509-3p靶向關系結果如圖4A所示，luc-FOXM1加入miR-509-3p處理后熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；構建FOXM1 pcDNA載體過表達FOXM1轉染至SKOV3/DDP細胞，RT-PCR和Western blot檢測FOXM1 mRNA水平及蛋白表達水平結果如圖4BC所示，與Control組比較，pcDNA-FOXM1組FOXM1 mRNA水平及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；通過Western blot檢測各組細胞FOXM1蛋白表達水平結果如圖4D所示，與Control組比較，miR-509-3p mimic組FOXM1蛋白水平顯著降低(P<0.05)。與mimic+pcDNA組比較，mimic+FOXM1組FOXM1蛋白水平顯著升高(P<0.05)。

2.5 miR-509-3p靶向FOXM1對SKOV3/DDP細胞存活率和凋亡的影響

通過CCK-8法檢測各組細胞活力結果如圖5A所示，與Control組比較，miR-509-3p mimic組細胞存活率顯著降低(P<0.05)。與mimic+pcDNA組比較，mimic+FOXM1組細胞存活率顯著升高(P<0.05)。通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡結果如圖5B所示，與Control組比較，miR-509-3p mimic組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與mimic+pcDNA組比較，mimic+FOXM1組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

3 討論

由于卵巢癌細胞在化療過程中極易發生耐藥效應，由于化療耐藥性的產生，半數以上患者在常規治療后仍然出現復發和轉移，5年生存率低于30%[7]。雖然順鉑是治療婦科惡性腫瘤最有效的化療藥物之一，但卵巢癌對順鉑耐藥是化療失敗的最主要原因[8]。尋找卵巢癌細胞耐藥的原因給予其有效的靶向治療是現階段面臨的一個重要問題。

與Control組比較：*P<0.05；與mimic+pcDNA組比較：#P<0.05

與Control組比較：*P<0.05；與mimic+pcDNA組比較：#P<0.05

近年來的研究表明，除了基因遺傳和表觀遺傳外，耐藥機制也可能受到miRNA調控。miR-509-3p在頭頸鱗狀細胞癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤中發揮著腫瘤抑制因子的作用[9]。Chen W等[10]研究發現體內miR-509-3p可下調卵巢癌細胞X連鎖凋亡抑制蛋白的表達，抑制癌細胞增殖，增加化療藥物的敏感性。Niu等[11]研究發現miR-509-3p可能靶GOLPH3和WLS基因，進而提高卵巢癌細胞對鉑類化療藥物的敏感性。

腫瘤細胞中細胞增殖與凋亡失衡是產生耐藥性的一個重要機制，而一些miRNA異常表達可誘導腫瘤細胞發揮作用，已有研究表明miRNA對凋亡信號通路的調控與卵巢癌耐藥性形成有關[12-13]。本文研究發現，miR-509-3p在SKOV3/DDP細胞中低表達，在SKOV3細胞中高表達，且轉染mimic后促進SKOV3/DDP細胞凋亡，抑制細胞存活，轉染inhibitor后抑制SKOV3細胞凋亡，升高細胞活力。說明過表達miR-509-3p可誘導卵巢癌細胞凋亡。

FOXM1是叉頭框轉錄因子家族成員，具有介導腫瘤細胞異常增殖、新生血管生成、上皮間質轉化、細胞逃逸衰老等效應，促進腫瘤細胞的發生發展[14]。過表達FOXM1在順鉑敏感的卵巢癌細胞增加順鉑耐藥和腫瘤球形成[15]，表明高表達FOXM1可導致腫瘤細胞耐藥。陳國慶等[16]研究發現抑制FOXM1表達可抑制人卵巢癌SKOV3細胞增殖。本實驗發現FOXM1 mRNA水平在SKOV3/DDP細胞中表達上調，在SKOV3細胞中表達下調，SKOV3/DDP細胞轉染miR-509-3p mimic后FOXM1蛋白表達下調，SKOV3轉染miR-509-3p inhibitor后FOXM1蛋白表達上調，生物信息學預測和熒光素酶報告實驗驗證發現FOXM1與miR-509-3p存在直接靶向作用關系。SKOV3/DDP細胞轉染miR-509-3p mimic并聯合轉染pcDNA-FOXM1下調SKOV3/DDP細胞FOXM1蛋白表達水平，升高存活率，抑制細胞凋亡。提示miR-509-3p靶向FOXM1逆轉SKOV3/DDP細胞順鉑耐藥。

綜上所述，miR-509-3p通過靶向FOXM1升高SKOV3/DDP細胞存活率，抑制細胞凋亡增強對順鉑的敏感性。本實驗為卵巢癌化療耐藥治療提供新的方向, miR-509-3p可作為卵巢癌的潛在治療靶點。