用Cyt b 基因分析松嫩平原區湖泊水庫大銀魚的遺傳多樣性

魯翠云，陳昕，那榮濱，鄭先虎，李喆，唐富江

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

大銀魚Protosalanx hyalocranius 隸屬于鮭形目Salmoniformes 銀魚科Salangidae，自然分布于我國錢塘江河口、長江口及長江下游湖泊、黃海、渤海沿岸河口及朝鮮半島西海岸和越南等。銀魚類均為一年生的小型魚類，大銀魚是銀魚類群中個體較大的物種，曾作為重點經濟魚類在我國北方大、中型湖泊和水庫廣泛移植[1-3]。近年來，松嫩平原區湖泊水庫大銀魚增殖漁業迅速發展，已成為我國最大的大銀魚產區，為漁業提質增效做出了貢獻，也對大銀魚資源起到了遷地保護的作用。大銀魚的研究主要集中在分類、生物學、移植增殖生態學上[4-6]，在遺傳學研究方面開展得相對較少。研究表明大銀魚的同工酶和隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA,RAPD）的多樣性均低于太湖新銀魚Neosalanx taihuensis 和寡齒新銀魚 Neosalanx oligodontis[7,8]。

線粒體細胞色素b（Mitochondrial cytochrome b,Cyt b）基因進化速率快,約為16S rRNA 的四倍[9]，適合于近緣物種間的系統進化研究。用Cyt b 基因序列研究銀魚科魚類的系統分化較多。羅宏偉等[10]研究表明三峽庫區大銀魚Cyt b 基因序列多態性較低。李大命等[11,12]對大銀魚Cyt b 基因分析表明太湖和洪澤湖群體均為單倍型多樣性高而核苷酸多樣性低的種群，即經過強捕撈遺傳瓶頸效應后伴隨著迅速的種群增長與突變的積累而形成。Xiao 等[13]指出淮河大銀魚線粒體Cyt b 基因多樣性較高。對于移植到北方的大銀魚種群，Tang 等[14]分析了移植到黑龍江、松花江、興凱湖等大銀魚的遺傳分化，結果顯示移植群體的遺傳多樣性較原種地太湖有大幅增加。在此基礎上，本研究利用Cyt b 全序列分析了移植到北方松嫩平原區湖泊、水庫的大銀魚群體的遺傳分化，可為大銀魚種群的遺傳管理和持續利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

大銀魚采自松嫩平原區的5 個湖泊水庫，分別為黑龍江省大慶市連環湖（LHH）72 尾和龍虎泡（LHP）49 尾，吉林省松原市查干湖（CGH）54 尾、長春市新立城水庫（XLC）22 尾和四平市二龍山水庫（ELS）29 尾，共226 尾。分別取其尾鰭，無水乙醇固定后，-20℃冷凍保存備用。

1.2 基因組DNA 提取

采用傳統的酚氯仿抽提法從大銀魚鰭條組織中提取基因組DNA[15]，使用NanoDropTM8000 分光光度計檢測所提取DNA 的濃度及純度，稀釋至50 ng/μL，4℃保存備用。

1.3 PCR 擴增與測序

使用引物L14321 和H15634 擴增大銀魚Cyt b基因全序列[16]，L14321 引物序列為5’-CCAGTGA CTTGAAAAACCACCG-3’；H15634 引物序列為5’-CTTAGCTTTGGGAGTTAAGGGT-3’，引物由上海生工生物公司合成。PCR 反應體系為25 μL，其中模板DNA 2 μL、混合PCR 緩沖液buffer 18 μL（10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200 μmol/L dNTP）、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL、Taq DNA 聚合酶1.5 U，其余體積用去離子水補充。擴增反應在ABI 9700 型PCR 儀上完成，反應程序為：94℃預變性7 min；94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30 個循環；72℃延伸5 min。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工生物工程技術服務有限公司純化后進行雙向測序及拼接。

1.4 序列分析

測序后，將序列輸入Clustal X 軟件[17]進行序列的對位排列，并加以人工校對，截取相同長度的序列用于群體遺傳分析。用DnaSP v5 軟件[18]統計變異位點類型和數目、計算單倍型數和核苷酸多態性等；用MEGA 7.0 軟件[19]分析序列的堿基組成和差異百分比、變異位點、簡約信息位點數、轉換/顛換值，用Kimura 2-Parameters 方法計算5 個群體間的遺傳距離，分別構建基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）和非加權配對算術平均法（unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA）的群體間發生關系的聚類樹，采用Bootstrap（重復數=1 000）檢驗分子系統樹各分支的置信度。利用Arlequin 3.11軟件[20]中的分子方差分析（AMOVA）計算群體間的遺傳分化系數（Fst）及遺傳變異組成。

2 結果與分析

2.1 核苷酸和氨基酸序列的特征

將所得序列在GenBank 中進行Blast 比對，結果確定為大銀魚線粒體Cyt b 基因的全序列[21]。所有序列經Clustal X 比對并加以人工校對后，截取1 141 bp 序列用于群體遺傳分析。經MEGA 7.0 分析，此序列可編碼380 個氨基酸。保守位點1 081個，變異位點60 個，其中單變異位點32 個，簡約信息位點28 個。測得的序列中A、T、C、G 的堿基組成分別為21.73%、29.27%、32.33%和16.67%，其中A+T 含量（51%）略高于C+G 含量（49%），轉換/顛換值為3.808。

2.2 單倍型及核苷酸多樣性

5 個群體226 個樣本的Cyt b 基因可分為38 個單倍型，其中單倍型Hap 4 的個體數最多（31.42%），其次為單倍型Hap 7（22.57%），且Hap 4和Hap 7 的個體分布于5 個群體中；單倍型Hap 3（8.85%）和單倍型Hap 15（3.98%）的個體分布于4個群體中，單倍型Hap 6（8.85%）的個體分布于3 個群體中，其余單倍型分布較少。各單倍型在群體中的分布見表1。

5 個大銀魚群體總體單倍型多態性（nh）為（0.833±0.016），核苷酸多樣性（Pi）為（0.00209±0.00020）。每個群體的單倍型數（nh）為5～16 個，LHP最少而LHH 最多;單倍型多樣性（Hd）在（0.656±0.051）和（0.939±0.028）之間，核苷酸多樣性（Pi）在（0.00121±0.00010）和（0.00496±0.00150）之間，LHP 多樣性最低而XLC 多樣性最高。Tajima's D 中性檢驗值的變化范圍為-1.89133～0.55966，中性檢驗結果顯示只有XLC（P＜0.05）顯著不符合中性突變，其他4 個群體均不顯著，符合中性突變（表2）。

2.3 群體遺傳分化

Cyt b 基因的AMOVA 結果表明，各群體間的遺傳差異主要來自群體內（93.81%），少數來自群體間（6.19%）（表3）。群體間遺傳分化系數（Fst）為0.06185，各群體間的遺傳分化系數（Fst）為0.01537～0.13572，除了查干湖與龍虎泡分化不顯著外，其余群體間分化顯著（P＜0.05），查干湖和連環湖、新立城和龍虎泡、二龍山水庫與龍虎泡和查干湖達到了極顯著的遺傳分化水平（表4）。

2.4 遺傳距離和系統進化樹的構建

利用Cytb 基因序列，采用MEGA 4.0 軟件，根據Kimura 雙參數模型計算各群體之間的遺傳距離（D）。結果顯示：XLC 和ELS 之間遺傳距離最大（0.0040），LHP 和LHH 之間遺傳距離最小（0.0014）（表4）。根據各群體之間的遺傳距離構建的系統進化樹顯示，CGH 和LHP 聚為一支后與LHH 聚為一支，再與ELS 聚為一支，XLC 獨立為一支（圖1）。

表2 基于線粒體Cyt b 基因的遺傳多樣性Tab.2 Genetic diversity estimates in the five populations of clearhead icefish based on Cyt b gene of mtDNA

表3 基于線粒體Cyt b 基因的AMOVA 分析結果Tab.3 The result of AMOVA based on Cyt b gene of mtDNA

表4 基于Cyt b 基因的各群體間的Fst 和基于Kimura 雙參數模型計算的各群體間遺傳距離Tab.4 The Fst among populations based on Cyt b gene and genetic distance calculated based on Kimura 2-parameter model in each population

3 討論

銀魚營養豐富、口感好、經濟價值高，是我國重要的出口創匯水產品之一。自20 世紀90 年代以來，陸續移植到全國27 個省（市）的湖泊、水庫進行養殖[23]，其中大銀魚個體大、冬季繁殖的生物學特性，使其具有較強的適應能力，特別是對寒冷有較強的耐受力，而在北方的湖泊水庫成功移植，在諸多省份形成了產量，獲得了顯著的經濟效益和社會效益[2]。

線粒體DNA（mtDNA）具有嚴格的母系遺傳、進化速率快、幾乎無重組等特點，被廣泛用于魚類系統發育和群體遺傳研究。其中Cyt b 基因作為重要的蛋白質編碼基因，進化速率適中，能有效反映屬、亞種、種群等不同群體水平的遺傳信息[22]，廣泛應用于銀魚系統進化及遺傳資源評估中[9-13]。用Cyt b 基因序列在原產地太湖和洪澤湖大銀魚群體中分別檢測到12 個和7 個單倍型，單倍型多樣性分別為（0.850±0.045）和（0.775±0.045），核苷酸多樣性分別為（0.00296±0.00017）和（0.00129±0.00010）[11,12]。本研究中，在松嫩平原區3 個湖泊和2 個水庫大銀魚群體中共檢測到38 個單倍型，單倍型多樣性為（nh）和核苷酸多樣性（Pi）分別為（0.833±0.016）和（0.00209±0.00020），略低于太湖群體而高于洪澤湖群體，其中連環湖群體和二龍山群體的單倍型數高于太湖，新立城水庫和二龍山水庫的遺傳多樣性指標也高于太湖群體，龍虎泡和查干湖群體遺傳多樣性較低。連環湖是嫩江下游平原型湖泊，本研究的樣本分別采自連環湖最下游的水體阿木塔泡和牙門喜泡，而所有連環湖水均經阿木塔泡后流入嫩江，因此，上游水源帶來的大銀魚增加了該水體大銀魚的遺傳多樣性。新立城水庫和二龍山水庫均為第二松花江支流的水庫，均采用人工投放受精卵的方式維持遺傳多樣性；兩水庫不僅與松嫩平原湖泊進行大銀魚種質交換，也與南方湖泊進行了較多的種質交換，增加了本地區其他湖泊不具備的單倍型，因此保持了較高的遺傳多樣性水平[23,24]。龍虎泡和查干湖均為獨立的水體，與外界水體溝通較少，增加遺傳多樣性的措施也為投放不同來源受精卵，但本研究顯示二者遺傳多樣性較低，應注重引進更廣泛水體的大銀魚受精卵。

AMOVA 結果表明：大銀魚遺傳差異主要來自群體內（93.81%），少數來自群體間（6.19%）。雖然群體間遺傳分化系數較低（Fst=0.06185），但是兩兩群體間遺傳分化均達到顯著水平或極顯著水平，顯示出各水體不同批次移植、投放大銀魚受精卵的特征；而查干湖與龍虎泡群體分化不顯著，可能是兩水體常態化交換投放受精卵的結果。聚類分析結果表明松嫩平原區湖泊連環湖、查干湖、龍虎泡首先聚類，然后再與第二松花江支流的二龍山水庫和新立城水庫聚類，體現出嫩江下游平原堿性湖泊遺傳相似度高而松花江兩水庫與其他各水體相似度均低的特征。

大銀魚在土著水域正面臨著資源衰退的問題，其廣泛移植不僅創造了很好的經濟效益和社會效益，也增加了我國這一獨有物種的遺傳多樣性，這對增強該物種的可持續利用具有重要意義。但是，大銀魚的移植增殖會明顯抑制其他魚類種群發展，特別是小型上層魚類，如屬Hemiculter sp.魚類等。因此，認為不應在水生生物保護區水域進行大銀魚移植增殖；同時，在管理大銀魚種群時要根據水體環境容納量確定大銀魚卵投放量和親魚保留量，防止過度放養和過度消耗餌料生物資源，保護其他魚類資源是大銀魚種群可持續發展和漁業利用的基礎。