硼替佐米通過PPARγ途徑抑制肺動脈平滑肌細胞TRPC蛋白的表達

田國英 徐磊

肺動脈高壓(Pulmonary hypertension，PH)是一類嚴重危害人類健康的疾病，可導致肺血管阻力和肺動脈壓力的進行性升高，從而發展為右心室肥厚，心力衰竭甚至死亡[1]。在過去幾十年間，雖然前列環素、內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑等靶向藥物的發現[2-3]推動了PH患者的臨床治療，但這些藥物療效有限，價格昂貴，而且只能延遲病程進展或緩解癥狀，無法有效延長患者的長期生存時間、降低疾病的死亡率[3]。此外兒童患者也給家庭帶來打擊和負擔[4]。因此研發新型的有效、適用、經濟的肺動脈高壓治療藥物具有十分重要的意義。近年來，有研究表明蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib，BTZ)對肺動脈高壓模型動物有較好的治療作用，但是其機制并不十分清楚。前期研究發現硼替佐米影響鈣池操縱性鈣內流(store-operated Ca2+entry, SOCE)是其治療肺動脈高壓的可能分子機制[5]。本研究將研究硼替佐米對肺動脈平滑肌細胞鈣池操縱性鈣通道(store-operated Ca2+channel，SOCC)組成蛋白TRPC1、6表達的影響并探討其分子機制。

資料與方法

一、主要試劑和儀器

倒置相差顯微鏡，為德國Leica公司產品。體式顯微鏡來自重慶奧特光學儀器有限責任公司。二氧化碳培養箱、三氣培養箱購自美國Thermo公司。硼替佐米、T0070907購自美國MCE公司。Cy3標記二抗購自美國Jackson公司。TRPC1、TRPC6、PPARγ兔源性多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin小鼠源性單克隆抗體購自美國sigma公司。HRP標記的羊抗兔及羊抗鼠二抗，均購于博士德公司。Ⅰ型膠原酶、木瓜酶、DTT購自美國Sigma公司。DMEM低糖培養基、胎牛血清購自美國GIBCO公司。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris堿、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、聚偏二氟乙烯膜、ECL化學發光液、蛋白電泳轉移系統均為美國Bio-rad公司產品；RIPA細胞裂解液購于中國碧云天生物技術公司；其余試劑均為國產分析純產品，購于廣州試劑公司。

二、實驗方法

1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠10只，體質量200～250 g，由內蒙古醫科大學實驗動物中心提供，自由飲食。

2 原代培養遠端肺動脈平滑肌細胞 大鼠處死前稱體質量，用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉，迅速取下心肺組織，置于預冷的有鈣HBSS溶液中，取出后，背側朝下固定心肺組織，加入適量有鈣HBSS液保持組織濕潤，于體視鏡下用顯微外科剪去除血管旁結締組織分離出肺動脈，用細胞刷輕輕刷除血管內壁的內皮細胞，獲得大鼠遠端肺動脈平滑肌組織。將分離好的血管平滑肌層放入消化酶內，置于37℃水浴箱內消化約18～20 min，加入1 mL含10% FBS的培養基中止消化，1000 r/min離心3 min，小心吸棄上清液，加入2～3 mL的含10% FBS的DMEM低糖培養基，用1 mL槍頭小心吹打10～15次左右，使細胞懸浮。將細胞懸液接種于35 mm細胞培養皿中，需要鑒定的細胞接種于放置有圓形蓋玻片的35 mm培養皿中，37℃細胞貼壁15～20 min，再補加適量培養基，37℃、5%CO2恒溫培養[6]。

3 細胞處理 待細胞融合度達到70%～80%時，將培養基換為含0.5% FBS的DMEM低糖培養基后再培養24 h。將細胞分為常氧組、常氧+BTZ組、低氧組、低氧+BTZ組。常氧組及常氧+BTZ組置于37℃、5%CO2培養箱恒溫培養。低氧組及低氧+BTZ組置于37℃、5%CO2、3%O2培養60 h。常氧+BTZ及缺氧+BTZ組在培養基內加入BTZ，使終濃度為10nM。另一批細胞，分為低氧組、低氧+BTZ組、低氧+BTZ+T0070907組，前兩組處理同前，低氧+BTZ+T0070907組在培養基內加入BTZ，終濃度為10nM；加入T0070907，終濃度為5nM。

4 TRPC1、TRPC6及PPARγ蛋白檢測 按文獻[7-8]使用蛋白免疫印跡法進行檢測，培養后的細胞，迅速用預冷PBS洗滌3次，每皿加RIPA裂解液50 μL，用細胞刷充分刮擦細胞，然后將標本轉移至1.5 mL EP管，置于冰上；搖床上冰上繼續裂解30 min；4℃離心機12 000 rpm，離心30 min；測定蛋白濃度。各組蛋白按40 μg上樣，用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，濃縮膠120 V，10 min，分離膠150 V，60 min；電轉法冰上轉膜，5%milk-TBST封閉1 h，一抗過夜，第二天用含0.1% tween 20的TBST洗膜3～5次后附二抗，常溫搖床孵育1 h后再用含0.1% tween 20的TBST洗膜3～5次，然后ECL發光液顯影并X線膠片曝光。

結 果

1 硼替佐米對大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC1蛋白表達的影響 Western blot結果表明(見圖1A、C)，低氧組大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC1蛋白相對常氧組的表達量為(158±11)%(P<0.01)，有統計學差異。低氧+BTZ組大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC1蛋白的表達為常氧組的(112±8)%，與低氧組相比，低氧+BTZ組大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC1蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。

2 硼替佐米對大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白表達的影響 Western blot結果表明(見圖1 A、D)，低氧組大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白相對常氧組的表達量為(146±9)%(P<0.01)，有顯著統計學差異。低氧+BTZ組大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白的表達為常氧組的(107±6)%，與低氧組相比，低氧+BTZ組大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。

3 硼替佐米對大鼠肺動脈平滑肌細胞PPARγ蛋白表達的影響 Western blot結果表明(見圖1 A、B)，低氧組大鼠肺動脈平滑肌細胞PPARγ蛋白相對常氧組的表達量為(65±7)%(P<0.01)，有統計學差異。低氧+BTZ組大鼠肺動脈平滑肌細胞PPARγ蛋白的表達為常氧組的(98±6)%，與低氧組相比，低氧+BTZ組大鼠肺動脈平滑肌細胞PPARγ蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。

圖1 硼替佐米對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)的TRPC1、TRPC6及PPARγ蛋白表達的影響

4 PPARγ抑制劑T0070907對硼替佐米介導的大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC蛋白表達的影響 Western blot結果表明(見圖2)，低氧+BTZ組大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC1蛋白相對低氧組的表達量為(65±7)%(P<0.01)，有顯著統計學差異。低氧+BTZ+T0070907組與低氧+BTZ組相比，TRPC1蛋白的表達顯著升高(P<0.05); 低氧+BTZ組大鼠肺動脈平滑肌細胞TRPC6蛋白相對低氧組的表達量為(71±5)%(P<0.01)，有著統計學差異。低氧+BTZ+T0070907組與低氧+BTZ組相比，TRPC6蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。

圖2 PPARγ抑制劑T0070907對大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)的TRPC1、TRPC6蛋白表達的影響

討 論

肺動脈高壓患病率約為全球人口的1%，65歲以上人群PH的患病率高達10%[9]。我們目前還沒有準確的關于PH發病率的數據，中華慈善總會估算我國約有1200萬肺動脈高壓患者。因此，肺動脈高壓已經成為嚴重危害人民群眾健康的一大類疾病。在過去十年間，雖然前列環素、內皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑等靶向藥物的發現[2-3]推動了PH患者的臨床治療，但這些藥物療效有限，價格昂貴[3]。肺動脈高壓的死亡率仍然繼續增長，在女性患者每年增加2.5%，在男性患者每年增加0.9%[4]。因此研發新型的有效、適用、經濟的肺動脈高壓治療藥物具有十分重要的意義。

硼替佐米是水溶性丙氨基酸硼酸衍生物，是第一個應用于臨床的蛋白酶體抑制劑，已用于治療多發性骨髓瘤、淋巴瘤、急性白血病、慢性粒細胞白血病和骨髓增生異常綜合征等[10-11]。近年來，有研究表明硼替佐米對肺動脈高壓模型動物有較好的治療作用[5,12-13]。其機制可能與影響平滑肌細胞一氧化氮信號通路和保護內皮等有關[14-15]，但其機制仍然有待進一步深入研究。張軍及我們前期研究者發現硼替佐米可以通過抑制低氧介導的肺動脈平滑肌細胞鈣穩態失衡從而抑制肺血管異常收縮和重塑，對肺動脈高壓起到治療作用。其具體的分子機制與硼替佐米可以抑制SOCC通道組成蛋白TRPC1、TRPC6及Orai1的表達有關[5,16]。本研究也驗證了硼替佐米可以抑制低氧介導的肺動脈平滑肌細胞TRPC1、6表達的上調。但硼替佐米是通過什么機制影響TRPC的表達有待進一步的研究。

近年來的研究發現，PPARγ配體激活 PPARγ 后，具有抗肥胖、高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤等疾病的有益作用，使得圍繞PPARγ 受體功能和配體篩選研究成為生物醫學和藥理學研究的前沿熱點，成為治療上述頑疾的新的藥物靶標。PPARγ活化后能夠抑制多種炎癥介質和細胞因子分泌，調節巨噬細胞活性，抑制炎癥細胞、平滑肌細胞、內皮細胞增殖遷移，具有抗炎、抗增殖、促凋亡的特性，并增強糖皮質激素的靶細胞效應，減輕氣道炎癥，防止氣道重構[15]，肺動脈高壓大鼠及特發性肺動脈高壓患者,肺內及血管上PPARγ表達減少[10]。

過氧化物酶體活性增殖物受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)與肺動脈高壓的關系研究近年來引起研究者的重視[17]，血管上皮組織特異性敲除PPARγ小鼠,會自發肺動脈高壓伴隨右心室肥大和遠端小肺動脈肌化。而靶向平滑肌PPARγ敲除的小鼠也會導致自發肺動脈高壓[18]。Wang等[19]發現PPARγ在大鼠肺動脈平滑肌細胞中可能通過抑制鈣池操作性鈣通道(SOCC)及TRPC表達發揮抗增殖、抗遷移、促凋亡的作用，而這些作用在缺氧或低氧誘導因子(Hypoxia inducible factor，Hif)1α累積的情況下被抑制。PPARγ可能通過抑制HIF-1α的表達及其信號轉導靶向調節SOCE和TRPC的表達，最終減緩慢性缺氧肺動脈高壓。本研究發現硼替佐米可以抑制低氧介導的PPARγ表達的下調，提示硼替佐米可能是通過影響PPARγ參與TRPC表達的調節。

因此本研究應用PPARγ特異性抑制劑T0070907刺激原代培養的肺動脈平滑肌細胞，發現硼替佐米對低氧介導的TRPC1、TRPC6蛋白表達上調的抑制作用被抵消，說明硼替佐米可能是通過PPARγ參與TRPC表達的調節。這為闡明硼替佐米治療肺動脈高壓的分子機制提供新的理論解釋：硼替佐米可能是通過PPARγ-TRPC-SOCE信號通路抑制低氧引起的肺動脈平滑肌細胞內鈣穩態失衡，從而達到治療肺動脈高壓的作用。但硼替佐米對TRPC1、TRPC6表達的抑制作用是否只通過影響PPARγ起作用，還是與其發揮蛋白酶體抑制劑作用相關？另外硼替佐米影響PPARγ蛋白的表達的分子機制，還有待進一步研究。綜上所述，本研究發現硼替佐米可以通過調控PPARγ表達參與低氧引起的肺動脈平滑肌細胞TRPC1、6蛋白表達的調節，從而揭示了硼替佐米治療肺動脈高壓的部分分子機制。