外泌體在肺癌診斷及治療中的應用前景

王麗 顧巖

肺癌是我國最常見惡性腫瘤。據我國2019年1月，國家癌癥中心發布的最新全國癌癥統計數據顯示，發病率和死亡率位居首位的仍是肺癌[1]。肺癌起病隱匿，多數患者首次就診時已處于中晚期，喪失了最佳治療時機。肺癌病理類型中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer NSCLC)最常見，約占80%～85%。Ⅰ期非小細胞肺癌患者術后5年生存率可達80%, 而晚期患者術后5年生存率僅為15%左右, 且術后復發率較高[2]。因此高效的肺癌診斷標志物，是患者得到早期診斷、及時治療、改善生活質量、延長患者生存期的有效途徑。近年來多項研究表明，外泌體作為細胞間生物信息媒介，在肺癌的發生發展中起著重要作用，同時發現了在診斷和治療方面的價值。本文著重從外泌體在肺癌診斷、治療方面的作用進行綜述。

外泌體概述

一、外泌體形成及其生物成分

外泌體(exosomes EXs)是組織細胞分泌的直徑約40～160 nm納米級脂質雙膜層結構的細胞外多囊泡體(extracellular vesicle MVB)。主要指由細胞膜內陷，起源于內小體的多囊泡體稱為exosomes，即外泌體,而由胞膜出芽方式分泌的囊泡，如微粒、微囊泡和大囊泡稱為Extosomes[3]。EXs最初細胞膜內陷形成早期內體，早期內體與細胞器相互作用，進一步形成管腔內囊泡(intraluminal vesicle，ILV)，ILV進一步成熟形成 MVBs[4]。MVB一部分與細胞膜融合以胞吐方式釋放外泌，另一部分被溶酶體降解，還有一部分經胞內高爾基體再循環[5]。

外泌體含有多種生物活性物質，如核酸、蛋白質、脂質等。核酸包括：信使RNA(mRNA)、非編碼RNA(miRNA、lncRNA)、單鏈DNA(ssDNA)、雙鏈DNA(dsDNA)等。脂質成分主要含有磷脂酰絲氨酸、鞘磷脂、神經酰胺、膽固醇[6]。蛋白質成分最為豐富，如整合素和四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81和CD8)、熱休克蛋白(如Hsp70、Hsp84)、Rab蛋白、腫瘤易感基因101蛋白(TSG101)、ALG-2相互作用蛋白X(ALix)、信號轉導蛋白、膜融合蛋白、基質金屬蛋白酶2(MMP2)等參與外泌體形成和分泌[3，7]。

二、外泌體細胞間通訊

外泌體攜帶其活性物質由細胞分泌到胞外，通過多種機制，進入靶細胞內，產生生物效應，改變受體細胞的生理病理狀態。外泌體可經自身表面蛋白分子,直接與靶細胞膜融合，也可以通過受體-配體介導的各種信號通路(MAPK/MAP、mTOR、TGFR-β)進入靶細胞[8]；而受體細胞通過網格蛋白依賴性內吞作用(clathrin-independent endocytosis，CIE)和巨胞飲作用(micropinoc-ytosis，MP)主動從其周圍環境中的攝取外泌體[3-4，9]。EXs進入靶細胞后，調節受體細胞基因表達及功能。EXs通過上述途徑參與腫瘤細胞增殖、轉移侵襲、血管生成、免疫抑制、耐藥等促進腫瘤發生發展過程。

外泌體在肺癌的診斷中的作用

外泌體因有脂質雙層膜分子結構保護，其內容物(蛋白質、miRNA)可保持穩定存在，研究顯示EXs在4℃, -20℃及-80℃條件下可保存3月至5年的時長[10]。腫瘤細胞分泌的EXs含有特異性蛋白質和核酸，能確切反映親代細胞特征。EXs廣泛存在于機體各種體液中，如血漿、唾液、淚液、尿液、羊水、支氣管灌洗、腦脊液、腹腔液、胸腔積液和精液等[11]。EXs與活組織檢查相比較，具有微創、取材方便、低風險、低成本，且能實時監測腫瘤動態等優勢，具有成為新型腫瘤標志物的潛力。

一、外泌體miRNA

肺癌患者和健康個體的組織和外周循環中外泌體miRNA表達譜不同，因而外泌體miRNA對肺癌早期診斷具有潛在的臨床價值。Rabinowits等[12]對肺腺癌患者血漿外泌體研究，結果顯示肺腺癌組的平均外泌體濃度為2.85 mg/mL(95%CI: 1.94～3.76)，對照組0.07 mg/mL (95%CI: 0.68～0.86)；肺腺癌組的平均外泌體miRNA 濃度為158.6 ng/mL (95%CI: 145.7～171.5) ，明顯高于對照組68.1ng/mL( 95%CI: 57.2～78.9)，差異表達均有統計學意義(P<0.001)，并且證實了周圍循環外泌體miRNA與腫瘤細胞分泌的外泌體imRNA結構極為相似，認為循環中外泌體miRNA在肺癌患者和對照組中的差異表達有助于肺癌篩查。Grimolizzi等[8]研究中納入45例NSCLC患者和31例健康個體，分別檢測早期NSCLC、晚期NSCLC和健康對照組的血清、外泌體、無外泌體血清中的miRNA-126，發現晚期NSLCL患者血清miRNA-126水平顯著下調。分析miRNA-126的分布情況，NSCLC的miRNA-126主要存在于外泌體中，且晚期NSCLC患者外泌體中miRNA-126水平更高，而健康對照組miRNA-126在血清和外泌體中分布均勻。評估血清miRNA-126和外泌體miRNA-126在肺癌診斷效能，受試者操作特征曲線分析(ROC)結果提示，外泌體miRNA-126的診斷肺癌的準確性更高。將NSCLC細胞來源外泌體與非腫瘤性上皮細胞(BEAS-2B)和內皮細胞共同孵育，觀察到NSCLC外泌體可使BEAS-2B細胞惡性轉化和血管生成。NSCLC細胞(A549)與人臍靜脈內皮細胞來源外泌體(富含miRNA-126)共同孵育，發現A549細胞中miRNA-126水平明顯升高，抑制A549細胞的增殖。表明NSCLC外泌體miRNA-126可誘導支氣管上皮細胞血管形成和惡性轉化，正常內皮細胞來源外泌體miR-126抑制NSCLC細胞的生長。發現miRNA-21也有促進腫瘤血管生成和惡性轉化的作用，通過激活STAT3基因，增加受體細胞中血管內皮生長因子(VEGF)的水平。可見，外泌體miRNA-126、miRNA-21作為肺癌的診斷性生物標志物和治療方法具有重要的應用前景。Zhang等[13]分析172名NSCLC患者和137名健康志愿者血清外泌體，發現miR-17-92家族中miR-17-5p在NSCLC患者血清中顯著上調(P<0.001)，其診斷效能評估,曲線下面積( AUC)值 0.746 (95%CI=0.677～0.806), 敏感度70.0%，特異度82.2%。外泌體miR-17-5p聯合3種腫瘤標志物(癌胚抗原，CEA；細胞角蛋白片段19，CYFRA21-1；鱗狀細胞癌抗原，SCCA)診斷效能明顯高于單個miR-17-5p診斷結果，其AUC為0.860 (95%CI=0.802～0.906), 敏感度63.0% ，特異度93.3%，同時觀察到高水平的miR-17-5p與肺癌淋巴結轉移有顯著相關性，因此miR-17-5p可用于肺癌輔助診斷及預后的生物標志物。有學者在外泌體促進塵肺患者癌變的研究中納入了54例塵肺患者和100例健康個體，通過實時定量PCR分析(RT-qPCR)方法檢測塵肺血清中外泌體，發現塵肺患者組外泌體let-7a-5p表達水平比健康對照組降低了21.67%，并在let-7a-5p中檢測到BCL2L1、IGF1R基因在肺癌中表達上調具有統計學意義(P<0.001)。BCL2L1基因高表達降低患者生存率HR (95%CI)=1.75(1.33～2.30)，而IGF1R基因表達對生存期無明顯影響 HR (95%CI) =0.79(0.62～1.02)。因而認為外泌體let-7a-5p通過調控BCL2L1靶基因促進塵肺患者的癌變。let-7a-5p、BCL2L1基因表達水平可用于肺癌早期診斷和預后監測[14]。此外，Kanaoka等[15]采用miRNA微陣列法分析6例NSCLC患者中復發者的血漿外泌體，發現miR-451a表達量顯著高于無復發及健康對照組。分析另外285例NSCLC患者(178例Ⅰ期、59例Ⅱ期、48例Ⅲ期肺癌患者)血漿中miR-451a表達，結果顯示，miR-451a表達水平隨疾病進展而增加，且與疾病分期、淋巴轉移相關。miR-451a的上調可降低肺癌患者總生存率及無病生存率，表明外泌體miR-451a在肺癌發展中起著促進作用。進一步研究發現經質粒將miR-451a載入NSCLC細胞系中可通過下調RAS相關蛋白抑制腫瘤細胞增殖。因此深入探究外泌體miRNA在肺癌中的差異表達及其作用機制，有利于肺癌早期診斷、預后監測生物標志物的開發和應用。

二、外泌體蛋白

外泌體內蛋白質含量最為豐富，在外泌體生物合成及細胞間信息傳遞中起著關鍵作用。在肺癌細胞來源外泌體蛋白質，如表皮生長因子、脂多糖結合蛋白質、轉化生長因子-β、整合素(α6β4 、α6β1)、四跨膜蛋白(TSPAN8)、信號轉導相關的蛋白質(GRB2 、SRC)等，在肺癌中的差異表達促進腫瘤細胞增殖、腫瘤微環境形成、促血管生成及腫瘤轉移等作用，在NSCLC診斷生物標志物開發有重要的臨床意義。Sandfeld-Paulsen 等[16]分析431例肺癌患者和150例對照者血漿外泌體中的蛋白質，發現CD151、CD171和TSPAN8蛋白在肺癌患者中表達顯著高于正常對照組(P<0.001)，且能區分肺癌組織類型：CD151、CD171在肺腺癌中上調明顯，而CD151、TSPAN8蛋白在肺鱗癌中表達明顯，而在小細胞肺癌中CD151是唯一表達水平升高的蛋白標志物。進一步采用多種標志物組合模型評估診斷肺癌的效能，結果顯示多種組合模型標志物診斷肺癌的準確率明顯優于單一外泌體蛋白質的診斷結果。Wang等[17]研究中納入89例轉移性NSCLC患者和94例NSCLC患者，分析肺癌細胞來源外泌體蛋白質的診斷作用，首先從部分非轉移性NSCLC患者、轉移性NSCLC患者及健康個體中鑒定出628種蛋白質，其中522種蛋白質被量化，發現43種蛋白質的差異表達(34種上調，9種下調)在NSCLC中具有調節腫瘤細胞的生物學功能和轉移作用。其中脂多糖結合蛋白質(lipopolysaccharidebind-ing proteins LBP)，在轉移性NSCLC患者外泌體中上調水平最明顯，是非轉移性肺癌外泌體中的含量高1.845倍，其診斷效能：曲線下面積(AUC):0.803，靈敏度為：83.1%，特異度為：67.9%。推測LBP是NSLCL轉移的驅動因子。另外，有研究分析NSCLC患者和慢性肺炎患者外泌體，發現NSCLC組外泌體中表皮生長因子受體(EGFR)表達量是慢性肺炎組的4倍，進一步研究肺癌來源外泌體攜帶的EGFR對樹突狀細胞(Dendritic cells，DC)的影響，結果顯示，外泌體EGFR可誘導腫瘤特異性調節T細胞(Tregs)，抑制腫瘤抗原特異性CD8T細胞的功能，從而促進腫瘤發生發展[18]。EGFR也可激活腫瘤細胞MAPK和 Akt 信號通路，促進腫瘤血管形成、促進發生發展，為肺癌診斷及靶向治療提供可靠依據[19]。

綜上研究顯示外泌體miRNA、蛋白質在肺癌的診斷、預后監測等方面有巨大應用價值，有望成為有效的肺癌診斷生物標志物。

外泌體在肺癌的治療中的雙向作用

一、外泌體可引起腫瘤細胞耐藥性，促進腫瘤發展

目前晚期肺癌的治療以化學、放射、分子靶向及免疫治療的綜合治療為主，但患者預后普遍較差，而治療中產生耐藥是治療失敗的重要原因之一。腫瘤細胞分泌的外泌體可介導腫瘤細胞產生耐藥，進而促進腫瘤的發展。Xiao等[20]研究發現順鉑(cisplatin，DDP)處理肺癌細胞(A549)后，富含miR-21的外泌體分泌量增加，將DDP處理的A549細胞與野生型細胞共同孵育，引起野生型細胞miR-21表達水平上調，并對DDP產生耐藥。NSCLC細胞miR-425-3p靶向作用于AKT1,上調腫瘤細胞自噬水平,降低NSCLC細胞對鉑類藥物的反應性，而導致耐藥[21]。另有研究表明吉西他濱耐藥NSCLC細胞(A549-GR)分泌的外泌體攜帶miRNA-222-3p(GR-Exo)經胞吞作用進入吉西他濱敏感細胞(A549-P)，從而引起A549-P的耐藥。miRNA-222-3p通過直接靶向細胞因子信號轉導抑制因子3(SCSO3)下調，促進腫瘤的復發和轉移[22]。外泌體還可以通過排除腫瘤細胞內藥物引起腫瘤細胞的耐藥性。Luciani等[23]在研究質子泵抑制劑對腫瘤細胞耐藥性影響的研究中發現，多種腫瘤細胞通過分泌外泌體排除化療藥物(鉑類、阿霉素類)，而產生耐藥。腫瘤細胞來源外泌體可以改變腫瘤細胞對放療的敏感性。研究證實經放療治療的NSCLC患者血清外泌體中miR-208a明顯上調，通過靶向P21基因和激活AKT/mTOR信號通路，降低NSCLC細胞對放射的敏感性，促進腫瘤細胞的G1期停滯[24]。有研究報道，吉非替尼耐藥的肺癌細胞分泌的外泌體富含miR-21，可引起吉非替尼敏感的細胞耐藥，認為miR-21是引起耐藥的關鍵分子[25]。可見miR-21不僅能引起常規化療藥物順鉑耐藥[26]，還能降低靶向藥物的治療效果。外泌體miRNA可通過多種方式介導腫瘤細胞產生耐藥，進而促進腫瘤發展。

二、外泌體抑制腫瘤作用

近年來外泌體在肺癌治療方面的研究越來越多，認為外泌體在肺癌的治療領域中有望為新的治療靶點。多項研究發現可通過減少外泌體含量、調控特異性miRNA的表達，增強腫瘤細胞對藥物敏感性、提高抗腫瘤免疫等途徑促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖、侵襲及轉移。以外泌體為靶點抑制腫瘤方式大致概括如下：①減少外泌體含量。有學者報道經血液透析減少循環系統中外泌體含量，為抗腫瘤治療提供輔助作用[27]。Fabbri等[28]在研究中發現給予肺癌小鼠注射外泌體抑制劑(GW4869)后，可抑制肺癌細胞增殖。②調控特異性外泌體的表達：Li等[29]證實耐紫杉醇肺腺癌細胞(A549/PTX)、順鉑耐藥肺癌細胞(A549/PTX)中mi R-181a過度表達，促進肺腺癌細胞(A549)細胞上皮間充質轉化(EMT)，而抑制miR-181a表達，可逆轉A549/PTX和A549/PTX細胞EMT表型，并增強肺腺癌細胞對紫杉醇和鉑類化療敏感性。上調外泌體miR-630在NSCLC細胞中的表達，通過靶向LM03蛋白，可抑制腫瘤細胞的生長增殖及轉移[26]。③外泌體提高抗腫瘤免疫。樹突狀細胞來源外泌體，具有激活免疫細胞、殺傷腫瘤細胞，促進瘤細胞調亡作用。在一項Ⅱ期臨床實驗中觀察到，22例對鉑類不敏感晚期NSCLC患者接受口服環磷酰胺聯合樹突狀細胞來源外泌體(皮下注射)，發現部分患者病情無進展，且體內NK細胞明顯被活化[30]。④增強藥物敏感性。Adi Harel等[31]研究證實，通過表觀修飾(DNA甲基化或組蛋白去乙酰化)激活miR-512和miR-373，增強肺癌細胞對順鉑的敏感性，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖遷移。外泌體miRNA也可以誘導腫瘤細胞對放射敏感，增強放射治療效果。外泌體miR-1246通過靶向死亡受體 5(DR5)來調節肺癌細胞對放射治療的敏感性[32]。⑤外泌體制劑，靶向腫瘤組織作用。Kim等[33]將紫杉醇(PTX)載入外泌體中制成外泌體紫杉醇制劑(exoPTX)，研究NSCLC中抗腫瘤作用，發現外泌體能夠將藥物足量有效的運送至腫瘤細胞內，并且對耐藥肺腫瘤有顯著治療效果。另有研究發現,在體內及體外實驗中載有雷公藤的外泌體制劑，對肺癌腫瘤的抑制作用明顯高于游離雷公藤的治療效果，且血液學及肝腎功能檢測表明無明顯毒副作用[34]。因此，肺癌相關外泌體的研究,將為肺癌精準有效的治療方面提供新的思路。

小結和展望

目前肺癌篩查相關輔助檢查(低劑量胸部CT、腫瘤標志物等)效率較低，而活組織檢查為侵入性檢查，風險高、并發癥多、無法進行多次活檢，難以了解腫瘤動態變化。外泌體內富含多種生物活性物質，能確切反應親代細胞特征，作為細胞間交流的重要媒介，可將其攜帶的生物活性物質傳遞給受體細胞，改變受體細胞的生物學行為，在肺癌的發生、發展、轉移中有重要意義。肺癌細胞源外泌體所含特異性成分，在肺癌的診斷及治療中顯示出重要的臨床價值。外泌體存在于機體多種體液中，作為潛在的新型腫瘤標志物，相對于傳統肺癌相關檢查，外泌體具有微創、取材方便、低風險、低成本，且能反復取樣，實時監測腫瘤動態等優勢。外泌體為脂質雙膜層結構分子，作為潛在的新型藥物載體，具有低免疫原性、高生物相容性、低毒性等優勢，直接靶向腫瘤組織，實現抗腫瘤治療。總之，肺癌細胞來源的外泌體在肺癌的診斷及治療中，有巨大的臨床價值。隨著對外泌體發生、細胞間信息傳遞機制的深入探究，相信外泌體將會在肺癌診斷及治療領域帶來良好的臨床應用前景。

表1 外泌體在肺癌中的作用