血清中STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表達及炎癥因子的變化在哮喘兒童中的診斷分析

褚保鳳 底建輝 方強 張麗 馬婷婷

哮喘是多種細胞及其組分參與的慢性非特異性炎癥性疾病，多發病于兒童。威脅兒童健康的最常見的慢性哮喘的發病機制相當復雜，該病具體的發病機制還不明確[1]。氣道炎癥和氣道重塑是該病的兩個主要病理特征，過度的炎癥因子表達與黏液分泌會導致氣道阻塞，也會導致上皮杯狀細胞增生/化生和黏膜下腺體增生肥大，從而在臨床上表現為氣道上皮纖維化、細胞外基質沉積等癥狀[2]。現代研究表明哮喘是一種免疫失衡性疾病，Th1/Th2平衡失調被認為是哮喘發病的關鍵機制，其中Th2釋放IL-6、TNF-α等促炎癥因子可致哮喘發病，IL-4、IL-13等抑炎癥因子可以促使B細胞合成IgE，拮抗Th2細胞反應，抑制哮喘發病[3-4]。信號轉導子和轉錄激活子(signal transducers and activators of transcription，STAT)是一類能與靶基因調控區結合的胞漿蛋白家族，其與酪氨酸磷酸化信號偶聯，發揮轉錄調控作用[5]；當前研究顯示STAT6在肺組織中的表達顯著高于其他器官，其能調控許多不同的生理過程，比如炎癥因子釋放、應激反應、轉錄沉默、染色質穩定性、細胞周期、凋亡、自噬、生長抑制等[6]。半乳糖凝集素(Galectin)家族在炎癥反應、免疫調節中也起重要作用，特別是在哮喘的發病中也起著不可或缺的作用，Galectin-9在哮喘患者的血漿及肺泡灌洗液中表達顯著增加[7]，但是與哮喘相關因子關系的方面還無相應的研究。胸腺基質淋巴細胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一種與IL-7類似的細胞因子，其作為氣道炎癥的上游調控因子，在哮喘發病中起著中心調控作用[8]。miRNA指長度約為22nt的特殊小型非編碼RNA，可抑制促進靶mRNA降解和/或mRNA翻譯過程，從而發揮對靶基因的負反饋調節作用[3]。miR-31在哮喘中呈現異常表達情況，也可參與哮喘的發生與發展過程。本文具體探討與分析了血清中STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表達及炎癥因子的變化在哮喘兒童中的診斷價值，以闡明哮喘的發生機制，為早期診斷哮喘與預測預后提供參考，現總結報道如下。

資料與方法

一、研究對象

本研究得到了醫院倫理委員會的批準，采用總結性研究方法，研究時間為2016年2月到2018年1月，選擇在北京市大興區人民醫院診治的哮喘患兒72例作為觀察組，納入標準：足月分娩，年齡在1～6歲的兒童；符合哮喘的診斷標準,處于哮喘緩解期患者；患兒家屬對本次研究具有知情權，且均自愿簽署知情同意書。排除標準：心力衰竭、呼吸衰竭等嚴重并發癥患兒；特應性體質史及家族特異性疾病史患兒；免疫功能低下、21-三體綜合征綜合征，嚴重佝僂病等患兒；低出生體重兒、慢性肺疾病、先天性氣道畸形患兒。

同期選擇健康兒童72例作為對照組，納入標準：近2周未患呼吸道感染的的健康體檢兒童，既往無哮喘史；無個人和家族特應性病史。

兩組患兒的資料對比，差異無統計學意義(P>0.05)。觀察組患兒平均病程3.10±1.40個月；發病程度：輕度32例，中度28例，重度12例(見表1)。

表1 兩組患兒的一般情況對照

二、指標檢測方法

檢測治療前1周及治療1個月時血清STAT-6、Galectin-9、TSLP指標，抽取兩組小兒的空腹靜脈血2～3 mL，靜置1 h后4℃ 3 000 r/min離心10 min(離心半徑為15 cm)，取上層血清，保存于-80℃冰箱。

采用酶聯免疫吸附測定(ELISA)法批量測定TNF-ɑ、IL-6等炎癥因子含量，檢測試劑盒購自上海生工公司。也采用ELISA法方法檢測STAT-6、Galectin-9、TSLP含量，STAT-6試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，Galectin-9試劑盒德國購自Laboratorien GmbH公司，TSLP試劑盒購自美國Biocheck公司。

檢測治療前1周及治療1個月時全血miR-31指標，取1.2中的血液樣本，EDTA抗凝后1 h內2 000 rpm/min離心10 min，取下層全血組織，用無RNA酶的EP管進行分裝，長期凍存于-70℃超低溫冰箱。按照美國Ambion公司的RNA提取試劑盒提取血漿的總RNA，采用qRT-PCR技術(7500 Fast Real-time PCR 儀，美國ABI公司)檢測全血中miR-31表達水平，以U2為內參。miR-31表達水平采用2-ΔΔCt計算。反應條件為95℃ 10 min，(95℃ 15s，60℃ 1 min)×40個循環，并設置3個平行復孔及陰性對照。

三、臨床資料調查

采用自行設計的統一問卷調查表，由專業人員對所有小兒家長采取問卷調查，調查內容包括小兒的性別、姓名、年齡、身高、潛在疾病史、既往病史、個人特應性體質史、特應性家族史。還包括觀察組患兒的病程、病情等，行常規哮喘檢測治療前1周及治療1個月的肺功能指標FEV1%和PEF%檢測。

四、統計方法

使用SPSS for Windows 20.00軟件包對本研究的所有計數、計量資料進行數據學分析，計數資料采用百分比表示，組間對比采用卡方檢驗，計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，關性分析采用Pearson相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、炎癥因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31含量對比

觀察組血清TNF-ɑ、IL-6等炎癥因子含量顯著高于對照組(P<0.05)。觀察組血清STAT-6、Galectin-9、TSLP1等含量顯著高于對照組(P<0.05)。觀察組的全血miR-31相對表達水平顯著高于對照組(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組血清TNF-ɑ、IL-6等炎癥因和含量對比(pg/ml，均數±標準差)

二、治療前后肺功能指標及癥因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表達

治療后肺功能指標FEV1%和PEF%均高于治療前，炎癥因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表達均低于治療前(P<0.05)(見表3)。

表3 治療前后肺功能指標及癥因子及STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31表達

三、相關性分析

在觀察組患兒中，Pearson相關性分析顯示血清TNF-ɑ、IL-6、Galectin-9、STAT-6、TSLP 、STAT-6、TSLP、miR-31含量與肺功能指標呈顯著負相關性，與病情等級成正相關(P<0.05)，與年齡無相關性(見表4)。

表4 哮喘兒童血清炎癥因子、STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31與肺功能的相關性(n=72)

四、ROC曲線分析

ROC曲線顯示炎癥因子TNF-α、IL-6的曲線下面積為0.922，0.947； STAT-6、Galectin-9、TSLP曲線下面積分別為0.918，0.927，0.936；miR-31曲線下面積為0.937，炎癥因子和STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31檢測兒童哮喘具很高的判斷價值。

討 論

哮喘是一種慢性反復發作性疾病，是一種以肥大細胞、T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞浸潤為主，伴有巨噬細胞、淋巴細胞等參與調節的氣道慢性炎癥性疾病。現代研究表明氣道炎癥，氣道高反應性及氣流受限是哮喘的三大特征，其中氣道炎癥是該病的病理基礎，炎癥因子的過量釋放在哮喘發生、發展過程中起主要作用[9]。IL-6是在機體內的淋巴和非淋巴組織細胞中產生的，IL-6可參加炎癥介質的級聯反應；TNF-ɑ被認為是引起哮喘的最重要細胞因子之一，TNF-ɑ可促進形成逐級放大的瀑布樣鏈鎖反應，誘導組織細胞損害[10-11]。本研究顯示觀察組血清TNF-ɑ、IL-6等炎癥因子含量顯著高于對照組(P<0.05)，表明哮喘伴隨有炎癥因子大量釋放狀態。

當前已有證據顯示信號通路是細胞間、細胞與細胞外基質一個重要的信息傳遞工具，參與機體的生理和病理過程。STAT6是STAT家族成員之一，STAT6傳導通路的異常與多種過敏性疾病密切相關[12]。STAT6基因轉錄產物可產生三種結構蛋白-STAT6a、STAT6b和STAT6c，STAT6通過JAK/STAT信號轉導途徑轉導細胞因子誘導的基因表達，促進B細胞分化和IgE的類型轉換，從而介導哮喘的氣道炎癥和氣道高反應性。Galectin-9含有11個外顯子，編碼蛋白約為36 kDa，其在組織中分布十分廣泛，多分布在胰島細胞、肺臟、免疫細胞、肝臟、扁桃體中。Galectin-9能誘導嗜酸性粒細胞聚集和活化，在細胞黏附、凋亡、分化、炎癥反應的調控中發揮著重要作用。外源性IFN-Υ刺激人臍靜脈內皮細胞產生Galectin-9[13]。TSLP是一種新型的主要由上皮細胞分泌、與IL-7類似的Ⅰ型細胞因子，主要表達于胸腺、氣道、腸道、扁桃體、胸腺細胞中。致敏原以及病原微生物可誘導機體內大量表達TSLP，促進初始T細胞向效應T細胞轉變，從而啟動哮喘、支氣管炎和皮膚過敏的炎癥反應。本研究顯示觀察組血清STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31等含量顯著高于對照組，提示上述因子在哮喘病程中發揮重要作用。當前也有研究表明TAT6敲除小鼠接缺乏典型的Th2相關趨化因子反應，STAT6可通過上調IgE血清水平而促進哮喘的發生[14]。Galectin-8通過與CD44的結合促進ICAM-I的分泌，從而與哮喘炎癥及氣道重塑。TSLP可以進一步啟動CD4+T細胞前體分化為Th2細胞，產生經典的Th2炎癥細胞因子，后者可進一步參與免疫級聯放大反應，從而參與哮喘氣道炎癥反應和氣道黏液高分泌發生。

圖1 不同因子的ROC曲線

哮喘具有一定的遺傳傾向，也是一種免疫失衡性疾病，已發現超過100個哮喘易感基因位點。而通過阻斷炎癥因子細胞生成、抑制其活化，減輕Th2介導的氣道炎癥，有望成為哮喘治療的新策略。本研究Pearson相關性分析顯示，觀察組患兒的血清TNF-ɑ、IL-6、STAT-6、Galectin-9、TSLP及全血miR-31指標與肺功能指標呈顯著負相關與病情等級正相關，提示這些指標能影響哮喘的病情。STAT6是介導過敏性炎性反應的重要因子，通常由Th2相關細胞因子如IL-6、TNF-α激活并誘導初始T細胞分化為Th2細胞以后，與哮喘易感性之間存在關聯[15]。最新研究表明STAT6是決定Thl型細胞因子作用的關鍵信號通路，IL-6、TNF-α刺激T細胞后，出現STAT6的活化[16-17]。Galectin-9具有特征性的氨基酸序列，由大約130個氨基酸序列組成高度保守的糖識別結構域；該因子可引起白細胞系的粘附，并對T細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、B細胞、中性粒細胞表現出重要的粘附活性；并且Galectin-9可促使整合素介導的酪氨酸磷酸化，使ERK1/2活性增高，釋放過氧化物，促進哮喘發作，進一步促使氣道重塑[18]。TSLP可激活未成熟的DC細胞，促進產生細胞因子IL-6、TNF-α等，能夠吸引嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞聚集Th2細胞，從而啟動過敏性炎癥[19-20]。miRNA是一類高度保守、長度很短的非編碼調控單鏈RNA，可在轉錄后水平，通過抑制靶基因mRNA翻譯或誘導靶基因mRNA降解，來調控靶基因的表達。miRNA可參與生命過程中一系列重要的進程，包括早期胚胎發育、腫瘤發生發展和侵襲轉移、細胞增殖、細胞凋亡、細胞死亡、脂肪代謝等。miR-31可作為肺癌、胃癌的診斷和預后靶標，并且其表達譜，在哮喘患者和正常人中不同，可作為診斷包括哮喘在內的多種疾病的標志物[21-22]。ROC分析顯示炎癥因子和STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31指標在哮喘的診斷中具有很高的判斷價值。不過本研究也有一定的不足，研究對象的入選存在一定的偏倚，不能排除個別對象存在高反應性，且研究的指標也相對較少，相關性分析還需要明確，將在下一步進行深入分析。

總之，哮喘患兒表現為血清STAT-6、Galectin-9、TSLP、miR-31含量顯著升高，并伴隨有炎癥因子TNF-ɑ、IL-6的釋放，與哮喘病情存在正相關性，可影響哮喘的發生。