核酸質譜檢測結核分枝桿菌耐藥方法的建立

余艷芳 趙開順 屠春林 陳娓 梁海鷹 易清清

2019年世界結核報告顯示，2018年全球結核潛伏感染人群占全人群的1/4左右(感染人群高達約17億)，其中結核新發病例近1 000萬，其中中國新發結核患者86.6萬；報告顯示我國58%初診結核病例(細菌學上確認)對利福平耐藥，復診患者(有治療經歷的患者)100%耐利福平，耐藥結核病(drug-resistant tuberculosis, DR-TB)尤其是耐多藥結核病(multidrug- resistant tuberculosis, MDR-TB)是嚴重影響中國乃至世界的公共衛生難題[1]。吡嗪酰胺、乙胺丁醇作為一線口服類抗結核藥物，其藥敏結果均存在不夠準確性，且吡嗪酰胺在耐多藥、廣泛耐藥結核病中的耐藥率較高，臨床上對于復診患者(有治療經歷的患者)應謹慎使用[2-3]。WHO強調，在治療耐藥結核病的強化期均使用一種二線注射類藥物，其中氟喹諾酮類藥物是治療耐多藥結核病最有效的藥物，并能夠用于不耐受現有一線抗結核藥物的患者[4-5]。臨床藥敏試驗是檢測結核耐藥的臨床金標準，但耗時久，導致的診斷延遲無論對于患者本身的治療，還是控制耐藥結核菌的傳播，都是十分不利的[6]。對于結核患者的耐藥檢測，臨床上迫切需要一種快速、準確的手段，減小延遲診斷導致的不良影響,由于耐結核藥物的臨床菌株的分子機制目前尚不完全明確，因此，分子生物學手段可作為傳統細菌學檢測的補充，不能完全代替藥敏檢測技術來鑒定臨床菌株的耐藥性[7-9]。

核酸飛行質譜檢測平臺是復雜生物樣品中痕量核酸進行全方位研究的技術平臺，具有通量高、檢測速度快、成本低的特點[10]，美國食品藥品監督管理局(FDA)于2014年批準MALDI-TOF MS可用于臨床核酸檢測，該技術其檢測效率、檢測通量均遠高于熒光定量PCR檢測，而檢測周期又遠低于傳統的一代測序和二代測序(≥18h)，少量的臨床標本也可進行多基因多位點的檢測[11-12]，可極大程度的滿足臨床檢測的需求。本研究基于MassARRAY核酸飛行質譜檢測平臺，分析復治患者(有治療經歷的患者)抗結核藥物異煙肼、氟喹諾酮類藥物(左氧氟沙星、莫西沙星)和二線注射類藥物(阿米卡星、卷曲霉素)的耐藥性，并與臨床藥敏測試結果對比，為建立快速準確的鑒定結核患者耐藥的分子檢測技術奠定一定的基礎。

資料與方法

一、一般材料

收集2016年1月-2019年6月上海市嘉定區中心醫院肺科肺結核復診患者(有治療經歷的患者)的菌培養樣本55例，最低抑菌濃度法(minimum inhibitory concentration， MIC)[13-14]鑒定為臨床耐藥的樣本45例，其中異煙肼和氟喹諾酮類耐藥45例，二線注射類耐藥23例，藥物敏感樣本10例。結核病患者中男性患者44例，女性患者11例，年齡范圍35～64歲，平均年齡47歲。培養其菌液樣本，提取DNA，用于后續實驗。

二、儀器與試劑

1 儀器

潔凈工作臺購自蘇州安泰技術有限公司(中國，VD-650-U)，PCR儀購自Eppendorf(德國)，板式離心機購自Eppendorf(德國，5804R)，去離子水儀購自上海舟技化工科技有限公司(中國，EasyQ-A0.5)，Hula翻轉搖勻儀購自其林貝爾儀器制造有限公司(中國， BQ-210)，MassARRAY? RS1000 Nanodispenser購自Agean公司(美國，63008)，MassARRY? Analyzer 4 System-96購自Agena公司(美國， 63010)。

2 試劑

Complete iplex pro genotyping reagent購自Agena(美國，10160)，PCR引物和UEP探針購自Genscript(中國)，菌株提取試劑盒購自寧波重鼎(中國，ZD-TG-08-100)。

三、方法

1 臨床耐藥菌株培養和提取

用最低抑菌濃度法(minimum inhibitory concentration， MIC)鑒定為MTB臨床耐藥的樣本45例，藥物敏感樣本10例，取其痰液2 mL，用2.94%和枸櫞酸鈉溶液和4%的NaOH溶液(用之前加0.5 g NALC)混合的溶液進行液化，振蕩30s，如果樣本粘稠，可適當延長消化時間，室溫(20℃～25℃)放置15 min，加入1/15 M PBS緩沖液20 mL，混勻，以3 000 g離心20～30 min，傾去上清液，加入1/15 M PBS緩沖液0.5 mL，混勻后接種于培養基中。接種的培養基在37℃孵育。培養后的菌株，提取菌液基因組DNA。MIC的臨床耐藥標準按照前人的研究中為標準進行判讀[13]。本實驗采用重鼎試劑盒提取結核分枝桿菌菌株基因組DNA。

2 耐藥相關位點引物和單堿基延伸引物(unextended extend primer,UEP)設計

表1 質譜檢測耐藥位點與藥物

MALDI-TOF MS其檢測原理為：基于多重PCR，檢測標本經普通PCR引物(多重)擴增后，將PCR擴增產物經蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase,SAP)去除PCR產物中的脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP)，純化后的產物在加入雙脫氧核苷三磷酸(dideoxy-ribonucleoside triphosphate, ddDNP)的體系中，經特異的單堿基延伸引物進行單堿基延伸反應，1個反應管可同時檢測高達40個SNP位點，且無需熒光標記[11]，將所獲得的延伸產物轉移至特制的芯片上并進行質譜分析。根據此原理，結合前人研究，針對異煙肼、氟喹諾酮類和二線注射類的阿米卡星、卷曲霉素耐藥相關位點設計引物(見表2)和UEP(見表3)，檢測涵蓋耐藥相關的6個基因的14個位點，利用MassARRAY? Assay Design Suite(Agena)進行設計引物和UEP設計。

表2 核酸飛行質譜檢測位點擴增引物表

表3 核酸飛行質譜檢測突變位點單堿基延伸序列表

3 核酸質譜檢測耐藥位點的突變與一代測序驗證

提取后的基因組DNA用于核酸質譜檢測，檢測方法概括為：配置反應液5 μL，進行PCR擴增，擴增程序為95℃ 2分鐘，(95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒)45個循環，72℃ 5分鐘；擴增后的產物取5 μL加入2 μL的SAP酶和緩沖液的混合溶液進行dNTP和多余引物的去除，程序為37℃ 40分鐘，85℃ 5分鐘；再加入2 μL的單堿基反應液(UEP反應液)2 μL進行檢測位點的單堿基延伸反應，反應程序為94℃ 30秒，(94℃ 5秒，52℃ 5秒，80℃ 5秒)40個循環，72℃ 3分鐘；將反應液中加入適量潔凈樹脂，在Hula翻轉搖勻30分鐘；將96孔板離心10分鐘，在MassARRAY? RS1000 Nanodispenser上點樣到芯片，將芯片在MassARRY? Analyzer 4 System-96上打質譜。將質譜檢測位點涉及的區域PCR擴增并用一代測序檢測該區域突變，比對與質譜檢測一致性。

四、統計學處理

以一代測序和MIC方法檢測的突變和臨床耐藥為金標準，敏感度計算方法為真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%；特異性計算方法為真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%；符合率計算方法為[(真陽性數+真陰性數)/檢測總數]×100%。應用統計學軟件SPSS 20.0進行Kappa檢驗，Kappa≥0.75認為一致性良好，Kappa在0.4～0.75之間認為一致性一般，Kappa<0.4認為一致性較差。[15]

結 果

一、臨床耐藥菌株培養和提取

將MIC方法鑒定為耐藥的菌株分離，培養后提取，耐藥培養結果和提取濃度結果(見表4)。

表4 耐藥菌株MIC結果

二、核酸質譜基因突變檢測與一代測序突變檢測結果比較

目前，單核苷酸多態性(SNP)的金標準驗證技術為Sanger測序技術[16]，，本研究中55株臨床菌株樣本的核酸質譜檢測與一代測序檢測結果(見表5)，其中檢測異煙肼的耐藥突變靈敏度為100%(37/37)，特異性為100%(18/18)；檢測氟喹諾酮類的耐藥突變靈敏度為100%(34/34)，特異性為100%(21/21)；檢測二線注射類的耐藥突變靈敏度為100%(10/10)，特異性為(45/45)。總體核酸質譜檢測與一代測序檢測一致率100%，一致性檢驗Kappa值為1。表明質譜檢測耐藥相關突變位點的準確性與金標準檢測方法一致，而相比一代測序，核酸質譜檢測更加快速，操作簡便。

表5 55例MTB菌株核酸質譜耐藥突變與一代測序檢測結果比較

三、核酸質譜基因型藥敏試驗與表型藥敏試驗對比結果

質譜檢測基因型藥敏與臨床表型藥敏的比對結果(見表2～3)。在45株異煙肼耐藥菌株中，質譜檢測含耐藥突變的菌株有37例，檢測靈敏度為82.2%(37/45)，特異性為分別為100%(10/10)；在45株氟喹諾酮類耐藥菌株中，質譜檢測含耐藥突變的菌株有34例，檢測靈敏度為75.6%(34/45)，特異性為100%(10/10)；在臨床藥敏檢測的23株二線藥耐藥株中，質譜檢測含耐藥突變的菌株有10例，全部為rrs基因1401 A→G的突變，檢測靈敏度為45.5%(10/22)，特異性為100%(33/33)。兩種方法的總一致率為89.1%，一致性檢驗Kappa值為0.703。

四、常見突變位點的分析

在45株異煙肼耐藥菌株中，KatG基因的315密碼子AGC→ACC為最常見突變，有36例(97.3%，36/37)，其中有12例樣本含有inhA-promoter的雙突變，且含雙突變的樣本，其臨床MIC檢測耐藥性更強(MIC≥8)。在45株氟喹諾酮耐藥菌株中，gyrA基因94密碼子GAC→GGC為最常見突變位點，有15例(44.1%，15/34)，與gyrA基因相關的突變樣本有32例(包含一代測序檢測出的突變樣本)。Y198、Y 47、Y 49、Y 51、Y 63樣本含有兩個突變，其臨床MIC檢測耐藥性更強(MIC≥16)。在臨床藥敏檢測的23株二線藥耐藥株中，質譜檢測含耐藥突變的菌株有10例，全部為rrs基因1401 A→G的突變。臨床檢測靈敏度與前人研究存在較大差異。

討 論

本研究中核酸質譜檢測基因變異與一代測序具有良好的一致性，并且在預測MTB菌株耐藥方面具有一定的一致性，可同時預測多種藥物的耐藥性，由于檢測法需8h獲得結果(其手工操作時間<30min)，1個反應管可同時檢測高達40個SNP位點，使其檢測效率、檢測通量均遠高于熒光定量PCR檢測，而檢測周期又遠低于傳統的一代測序和二代測序(≥18 h)，少量的臨床樣本也可進行多基因多位點的檢測，可極大程度的滿足臨床檢測的需求[12]。

表6 55例MTB菌株核酸質譜基因型藥敏試驗與表型藥敏試驗結果比較

研究發現，超過80%的異煙肼耐藥與KatG基因及inhA 基因突變相關，本研究用一代測序對KatG基因和inhA基因的突變熱點區域進行檢測，發現本研究耐藥突變檢測位點中不包含的katG基因315位密碼子AGC→ACG和inhA 基因promoter(-34)C→T兩個突變位點，而在其他的研究中，這兩個位點的突變發生頻率很低[17]；氟喹諾酮類藥物耐藥與gyrA基因和gyrB基因突變相關，gyrA基因耐藥決定區(quinolone resistance determining region, QRDR)發生 突變可以解釋60%～90%的菌株耐藥，且gyrA基因和gyrB基因雙突變的菌株表現為高水平的耐藥[18-19]，本研究與前人的研究相符。Ruiru Shi[20]等人，研究顯示gyrA雙點突變報道較多，其研究中有56%的臨床菌株存在gyrA基因雙突變，Avalos E[19]等人研究顯示，僅1%～3%的耐藥菌中存在 gyrA 基因雙突變，本研究總共31例在gyrA基因突變的菌株中(包含一代測序結果)，含2株(6.25%，2/32)gyrA雙點突變株，可能與各研究中不同的檢測方法和檢測區域有關，也可能與不同區域的菌株本身突變特性相關。本研究用一代測序方法篩查gyrA基因和gyrB基因的序列，發現gyrA基因的(70位密碼子CAC→CGC)和gyrB基因的(539位密碼子ACC→GCC、543位密碼子GCG→ACG、551位密碼子GGG→AGG)突變型均不在喹諾酮類藥物的耐藥決定區，是值得關注的耐藥突變相關位點。

本研究中二線注射類藥物的靈敏度為45.5%，與前人研究結果差異較大，總結國內外部分研究發現[21-22]，通過該位點的突變檢測結核菌株耐藥的靈敏度從1.8%～100%范圍內不等，其中在中國人群中，靈敏度從50.6%～86.4%不等。由于本研究所有檢測標本均進行一代測序驗證檢測，且驗證結果和核酸質譜多重檢測結果一致，因此可排除由于多重PCR設計導致引物間相互作用致使其檢測不到耐藥突變，因此，推斷二線注射類藥物靈敏度低可能是本研究中二線注射類耐藥患者納入的臨床研究標本相對較少，也可能由于設計涉及的耐藥突變位點(rrs基因A1401G)與臨床耐藥存在地域性差別，或者是該類菌株存在其他耐藥位點或其他耐藥機制，這擴大研究標本量和擴大突變檢測區域進行更進一步的驗證。