微小RNA-190低表達調控肺癌A549細胞增殖、侵襲和凋亡的實驗研究

崔杰 耿利民

肺癌是全球癌癥死亡的重要原因，其發病率和死亡率一直居高不下，嚴重威脅著人們的身體健康[1-2]。肺癌的發生與發展是一個多因素、多階段和多基因調控的復雜過程，其發生發展的分子機制尚不完全清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類由17-25個核苷酸組成的非編碼RNA，可調控人類約30%基因，與腫瘤的發展發展密切相關[3]。既往研究[4-5]顯示，miRNA可通過與相關靶基因3’非翻譯區(3’-untranslated region，3’UTR)特異性結合影響細胞功能在肺癌中發揮著癌基因或抑癌基因的作用。越來越多的研究[6-8]顯示，miR-190在結直腸癌、乳腺癌和胰腺癌等多種腫瘤組織中異常表達，且可通過調控細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化等參與腫瘤的發生發展。已有學者[9-10]指出，miR-190在肺癌中表達上調，且與患者預后密切相關，但其在肺癌中的作用并不清楚。本研究旨在探討miR-190低表達對肺癌A549細胞增殖、侵襲和凋亡的影響及其機制，以期為肺癌的發生發展機制及治療提供新線索。

資料與方法

一、實驗材料

人肺癌細胞株A549(中科院上海細胞庫)，miR-190模擬物、miR-190抑制劑及其陰性對照(廣州銳博生物公司)，DMEM培養基、胎牛血清和青鏈霉素(美國Hyclone公司)，胰蛋白酶(北京鼎國生物公司)，脂質體2000(美國Invitrogen公司)，辣根過氧化物酶標記的二抗(碧云天生物公司)，Trizol試劑(康為世紀生物公司)，兔抗人生長分化因子11(growth differentiation factor 11，GDF11)和β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(美國Abcam公司)，噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)試劑和二甲基亞砜(美國Sigma公司)，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(美國默克生物公司)，反轉錄試劑盒(美國Life Technologies Corp公司)，熒光素酶報告基因檢測試劑盒和膜聯蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)細胞凋亡檢測試劑盒(北京博邁斯科技公司)，psiCHECK-2熒光素酶載體(西安賽拓博泰生物)。Transwell小室和流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)，CO2細胞培養箱(美國Heraeus公司)，多功能酶標儀(美國BioTek公司)，倒置顯微鏡(美國OLYMPUS CK40公司)，熒光定量PCR儀(美國Life Technologies公司)，凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

二、細胞培養、分組及轉染

使用含100 U/mL青鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5% CO2常規條件的細胞培養箱中培養A549細胞。將指數期的A549細胞以每孔3×105個接種至6孔細胞板上，置于細胞培養箱中常規培養過夜。實驗分為對照(Ctrl)組、抑制劑陰性對照(anti-miR-NC)組和miR-190抑制劑(anti-miR-190)組，每組設置3個復孔。待細胞培養至70%匯合度時，參照脂質體2000說明書步驟將miR-190抑制劑/抑制劑陰性對照根據實驗分組加入到A549細胞中。轉染5h后更換新鮮培養基，繼續培養48h后收集各組細胞并采用實時熒光定量PCR儀檢測細胞中miR-190的表達水平以評價轉染效果。

三、實時熒光定量PCR檢測細胞中miR-190的表達

采用Trizol法提取A549細胞的總RNA后，使用紫外分光光度計檢測RNA的濃度與純度。再參照反轉錄試劑盒說明書步驟將RNA進行逆轉錄，將逆轉錄產物cDNA作為模板，根據上海生工生物合成的引物(miR-190 F:5’-GGGTGATATGTTTGATATATTAGG-3’,R:5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’;U6 F:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,R:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’)按照PCR反應條件(94℃ 300s，94℃ 30s、58℃ 30s，共38個循環)進行PCR擴增。以U6作內參，2-ΔΔCt法計算A549細胞中miR-190的表達水平。重復3次。

四、MTT法檢測細胞增殖

將指數期A549細胞以每孔3×104個接種至96孔細胞板上后，將其按照1.2中進行分組并轉染。分別轉染12 h、24 h、48 h和72 h后棄培養液，加入濃度為5g/L的MTT試劑20μL/孔，孵育4 h后，再加入二甲基亞砜震蕩10 min。采用多功能酶標儀在492 nm波長處檢測各組細胞的光密度值。重復3次。

五、Transwell小室實驗檢測細胞侵襲

胰蛋白酶消化收集轉染48 h后的anti-miR-NC組、anti-miR-190組及未轉染的Ctrl組細胞后，使用無血清的DMEM培養基制備濃度為105個/mL的細胞懸液。在鋪于基質膠的Transwell小室的上室中加入細胞懸液300μL，同時下室中加入含血清的DMEM培養基800 μL，置于細胞培養箱中孵育24 h。使用磷酸緩沖液對取出的Transell小室洗滌后，以4%甲醛固定細胞25 min，再以0.1%結晶紫染色15 min。洗去染色液后，放于倒置顯微鏡下觀察拍照并統計穿膜細胞數，結果以隨機選取3個高倍視野(200×)內細胞數的均值表示。重復3次。

六、流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集轉染48h后的anti-miR-NC組、anti-miR-190組及未轉染的Ctrl組細胞，使用磷酸緩沖液洗滌后，加入500μL結合緩沖液重懸細胞。先后加入 Annexin-V-FITC和PI 各5 μL后，室溫下避光反應10 min。使用流式細胞儀在60 min內檢測各組細胞的凋亡率。重復3次。

七、雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-190和GDF11的靶向關系

生物信息學軟件預測發現GDF11 3’UTR區與miR-190存在互補的結合位點，將克隆擴增GDF11的3’UTR片段重組至psiCHECK-2熒光素酶載體上，作為GDF11野生型(GDF11-WT)報告基因載體；另外，將miR-190與GDF11 3’UTR結合的位點進行定點突變后重組至psiCHECK-2熒光素酶載體上，作為GDF11突變型(GDF11-MUT)報告基因載體。參照脂質體2000說明書步驟將構建的GDF11-WT和GDF11-MUT載體分別與miR-190模擬物/抑制劑、模擬物/抑制劑陰性對照共轉染至A549細胞中，分別標記為GDF11-WT+miR-190/anti-miR-190組、GDF11-WT+miR-NC/anti-miR-NC組、GDF11-MUT+miR-190/anti-miR-190組、GDF11-MUT+miR-NC/anti-miR-NC組。轉染48 h后參照熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測各組細胞的熒光素酶活性。

八、免疫印跡法檢測細胞中GDF11蛋白的表達

將指數期的A549細胞以每孔105個接種至6孔細胞板上后，置于細胞培養箱中常規培養。細胞分為miR-190模擬物(miR-190)組、模擬物陰性對照(miR-NC)組、anti-miR-190組和anti-miR-NC組，其中每組3個復孔。參照脂質體2000說明書步驟根據上述分組將miR-190模擬物/抑制劑及模擬物/抑制劑陰性對照轉染至A549細胞中，轉染48 h后胰蛋白酶消化收集各組細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，并采用BCA法檢測總蛋白的濃度。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混勻后，在沸水浴中煮沸5 min。將變性后的蛋白樣品加入到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。待電泳結束后，轉至聚偏二氟乙烯上。以5%脫脂奶粉封膜2 h后，加入1 ∶1 000比例稀釋的GDF11和β-actin抗體并在4℃下孵育24 h。棄一抗后，再以1 ∶2 000比例稀釋的二抗室溫孵育1.5 h。經化學發光劑顯影曝光后，以β-actin為內參，采用凝膠成像系統掃描分析各組細胞中GDF11蛋白的表達水平。重復3次。

九、數據分析

結 果

一、轉染后肺癌A549細胞中miR-190表達

實時熒光定量PCR檢測結果表1顯示，在轉染miR-190抑制劑陰性對照的anti-miR-NC組中miR-190的表達水平與Ctrl組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但在轉染miR-190抑制劑的anti-miR-190組中miR-190的表達水平較Ctrl組明顯降低(P<0.05)(見表1)。

表1 轉染后各組細胞中miR-190表達水平

二、miR-190低表達對肺癌A549細胞增殖的影響

MTT法檢測結果表2顯示，轉染12 h～72 h后anti-miR-NC組細胞的增殖活力與Ctrl組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但轉染24 h～72 h后anti-miR-190組細胞的增殖活力較Ctrl組明顯降低(P<0.05)(見表2)。

表2 轉染不同時間后各組細胞光密度值的比較

三、miR-190低表達對肺癌A549細胞侵襲的影響

Transwell小室檢測結果圖1和表3所示，與Ctrl組比較，anti-miR-190組中侵襲細胞數明顯減少(P<0.05)，但anti-miR-NC組與Ctrl組比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表3,圖1)。

表3 各組中侵襲細胞數和細胞凋亡率的比較

圖1 Transwell小室檢測各組細胞侵襲結果(×200)

四、miR-190低表達對肺癌A549細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果圖2和表3所示，anti-miR-NC組細胞凋亡率與Ctrl組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但anti-miR-190組細胞凋亡率較Ctrl組明顯升高(P<0.05)(見表3,圖2)。

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡結果

圖3 miR-190和GDF11的關系分析

五、miR-190靶基因的預測及其驗證

TargetScan生物學信息學軟件預測結果圖3A所示，GDF11 3′ UTR與miR-190存在互補的結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗檢測結果表4所示，與相應對照miR-NC和anti-miR-NC組比較，轉染miR-190模擬物可明顯降低GDF11-WT質粒轉染的A549細胞熒光素酶活性，而轉染miR-190抑制劑可明顯升高其熒光素酶活性(P<0.05)；但轉染miR-190模擬物或miR-190抑制劑后GDF11-MUT質粒轉染的A549細胞的熒光素酶活性與相應對照比較差異無統計學意義(P>0.05)。同時，免疫印跡法檢測結果圖3B和表4所示，轉染miR-190模擬物可明顯抑制A549細胞中GDF11蛋白的表達，而轉染miR-190抑制劑則明顯促進GDF11蛋白的表達(P<0.05)(見表4，圖3 A、B)。

表4 各組細胞熒光素酶活性和GDF11蛋白表達水平的比較

討 論

肺癌是常見的呼吸系統腫瘤，由于其發病隱匿的特性，多數患者就診時已為晚期，錯失了根治性手術治療的最佳時期，患者在5年內的生存率只有15%左右[1,11]。因此，深入探討肺癌發生發展的分子機制尋找新的、有效的治療靶點十分必要。

miR-190是一條高度保守的miRNA，位于15號染色體的talin2基因的內含子區域；其在不同腫瘤中呈現不同表達，且發揮著不同的作用。例如：miR-190在乳腺癌中表達下調，不僅可通過調控TGF-β誘導的上皮-間質轉化在癌轉移過程中發揮著抑制作用[12]，還可通過靶向Sry相關高泳動類非組蛋白基因9(Sry-related high mobility group-box gene 9，SOX9)抑制Wnt /β-連環蛋白(β-catenin)信號傳導提高抗雌激素敏感性[13]；miR-190在膠質瘤中表達下調，且可通過調控細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡發揮抑癌作用[14]；然而，miR-190在肝癌中表達上調[15]，可通過靶向抑制PH結構域且富含亮氨酸重復基序的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶1(pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase 1，PHLPP1)的表達在癌細胞增殖和轉移過程中發揮著重要的促進作用[16]。盡管已有學者[9-10]指出，miR-190在肺癌中表達上調，但其發揮的作用并不清楚。本研究通過轉染miR-190抑制劑成功下調miR-190表達后發現，肺癌A549細胞的增殖活力和侵襲能力明顯減弱，同時細胞凋亡能力明顯增強。結果表明，miR-190低表達可抑制肺癌A549細胞增殖、侵襲并促進細胞凋亡。這提示miR-190可通過調控細胞增殖、侵襲和凋亡參與肺癌的發生發展。

GDF11是轉化生長因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)超家族成員，在胚胎正常發育過程中發揮著重要作用。研究顯示，GDF11在肝癌和食管癌等中異常表達，且可通過調控細胞增殖、侵襲和凋亡等發揮著重要的抑癌作用[17-18]。已有研究[19-20]指出，GDF11低表達與肺癌患者的惡性程度高有關，且外源表達GDF11后可通過p53、葡萄糖轉運因子1(glucose transporter type1，GLUT1)、 B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease，MMP-2)等蛋白抑制細胞增殖、轉移并促進細胞凋亡。本研究進一步對miR-190的靶基因進行預測，結合相關資料，最終將GDF11作為研究對象。生物信息學軟件預測發現GDF11 3’UTR區域與miR-190存在互補的結合位點，同時采用雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-190可與GDF11 3’UTR靶向結合；免疫印跡法進一步檢測證實miR-190可負向調控GDF11蛋白的表達。結果表明，GDF11是miR-190的靶基因。這提示，miR-190調控肺癌細胞增殖、侵襲和凋亡可能與靶向調控GDF11表達有關。

總之，miR-190低表達可抑制肺癌A549細胞增殖與侵襲并促進細胞凋亡，其作用機制可能與靶向調控GDF11表達有關。該結果豐富了肺癌發生發展的分子機制，也為肺癌的治療提供了新線索。