IL-33基因多態(tài)性及其血清水平與云南宣威肺癌的相關(guān)性研究

呂國(guó)利 雷又鳴 李楊 施云飛 段晉 劉寅強(qiáng) 趙煒

肺癌是由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與炎癥反應(yīng)的一種惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和極高的死亡率[1]，發(fā)病機(jī)制與遺傳因素、環(huán)境因素、免疫炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[2]。白細(xì)胞介素33(interleukin 33,IL-33)作為一種多功能因子，其位于5’端或第一內(nèi)含子區(qū)的SNP位點(diǎn)，可結(jié)合位于細(xì)胞表面的致癌性抑制基因及相關(guān)受體復(fù)合物，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致IL-33血清水平發(fā)生改變[3]，大量研究證實(shí)IL-33基因多態(tài)性及IL-33水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。云南宣威是肺癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一[4]，至今其發(fā)病原因仍無(wú)統(tǒng)一共識(shí)。IL-33基因多態(tài)性及IL-33水平是否與云南宣威肺癌的易感性有關(guān)，目前尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。人類基因組掃描圖譜所公布的IL-33基因rs10975521是重要SNP位點(diǎn)之一。因此，本研究通過(guò)分析IL-33基因rs10975521位點(diǎn)的多態(tài)性及血清IL-33水平與云南宣威肺癌的相關(guān)性，為云南宣威肺癌防治提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

收集2018年5月至2019年12月在我院治療的肺癌患者作為肺癌組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理確診原發(fā)性肺癌新發(fā)病例；(2)未經(jīng)過(guò)任何手術(shù)、放療、化療、分子靶向等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)合并慢性疾病、嚴(yán)重代謝性疾病。符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的患者共100例，男43例，女57例；年齡27～68歲，平均(35.89±5.23)歲。同期選取100例健康人群作為對(duì)照組，男42例，女58例；年齡26～68歲，平均(35.72±5.27)歲；既往無(wú)腫瘤病史，甲胎蛋白和癌胚抗原陰性，近期無(wú)感染史。兩組的年齡、性別等基線資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究已獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，兩組受試者均為云南宣威籍，相互之間不存在親屬關(guān)系，所有研究對(duì)象及家屬均對(duì)本研究知情，且自愿簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1 標(biāo)本采集 于清晨抽取受試者的靜脈血2管(每管各約3mL),1管置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內(nèi)，用于DNA的提取；另1管上離心機(jī)以3000r/min離心15min，提取血清，用于酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定。

2 IL-33基因多態(tài)性實(shí)驗(yàn) ①DNA提取：采用全血DNA 純化試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)進(jìn)行DNA 提取，紫外分光光度儀測(cè)定其含量，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。②引物合成：委托上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行合成，rs10975521(正向引物：5′-TTGCATGCCAACAACAAGGAAC-3′，反向引物：5′-CCCCAACACCCAAATCTACACAA-3′，延伸引物：5′-TTTT-TTTTTTTGACAGTTCTGTAATCATATA-TATAGATATA-GATAA-3′)。③PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系[樣本DNA(1.0 μL)、 PCR緩沖液(2.0 μL)、dNTPs(2.0 μL)、Taq DNA聚合酶(1.0 μL)、兩端引物(1.0 μL)、體積用滅菌雙蒸水13 ul，共20 μL]。PCR循環(huán)(95℃ 2 min、95℃ 20 s、60℃ 1 min、72℃延伸15 min)，共24個(gè)循環(huán)。延伸產(chǎn)物在ABI3730XL上樣并用Gene Mapper 4.1分析其基因多態(tài)性，采用測(cè)序法進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。

3 血清IL-33測(cè)定 采用ELISA法檢測(cè)血清中的IL-33表達(dá)水平，所用試劑盒購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)公司，檢測(cè)者按照試劑盒操作步驟進(jìn)行加樣，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔及復(fù)孔，采用酶標(biāo)儀在450 mm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制軟件下完成曲線繪制，計(jì)算出血清IL-33表達(dá)水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、IL-33點(diǎn)位基因型頻率在肺癌組和對(duì)照組的HWE檢驗(yàn)

HWE定律兩組IL-33 rs10975521G/A位點(diǎn)基因型檢驗(yàn)顯示，觀測(cè)值與理論值的比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示本實(shí)驗(yàn)對(duì)象具備群體代表性(見(jiàn)表1)。

表1 IL-33點(diǎn)位基因型頻率在肺癌組和對(duì)照組的HWE檢驗(yàn)

二、 IL-33基因rs10975521位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在各種族人群間分布

IL-33基因rs10975521的AA、GA、GG基因型及等位基因的分布頻率分別與1000 Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)中北京漢族、日本人、歐洲人、非洲人相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：云南宣威IL-33基因rs10975521位點(diǎn)的基因型及等位基因與北京人、非洲人之間具有顯著性差異(P<0.05)，其余兩個(gè)種族無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 IL-33基因rs10975521基因型及等位基因頻率在各種族人群間分布

三、IL-33基因rs10975521基因型分布與肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析

在IL-33基因rs10975521位點(diǎn)多態(tài)性中，肺癌組攜帶AA基因型頻率高于對(duì)照組，肺癌組與對(duì)照組的AA、GA、GG各基因頻率分布的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.066，P=0.048)。AA和GA基因型分布與GG基因型對(duì)比發(fā)現(xiàn)，攜帶AA基因型與增加肺癌風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性(OR=1.59，CI:1.18～3.53,P=0.016)；攜帶GA基因型與增加肺癌風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。在等位基因頻率中，肺癌組A等位基因占比高于對(duì)照組，肺癌組與對(duì)照組的A、G等位基因比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.193，P=0.013)。A等位基因型與G等位基因型比較，A等位基因型發(fā)生肺癌風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因型的1.35倍(OR=135，CI: 1.25～3.97,P=0.022)(見(jiàn)表3)。

表3 rs10975521基因型分布與肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性分析

四、兩組血清IL-33表達(dá)水平比較及不同基因型對(duì)IL-33水平的影響

肺癌組的血清IL-33表達(dá)水平(27.89±6.85)pg/mL明顯高于對(duì)照組的(20.13±5.97))pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.540，P<0.001)。在IL-33基因rs10975521的AA、GA、GG基因型中，肺癌組的三種不同基因型之間血清IL-33表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組的的三種不同基因型之間血清IL-33表達(dá)水平比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；肺癌組AA、GA基因型的IL-33表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組GG基因型的IL-33表達(dá)水平比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 兩組血清IL-33表達(dá)水平比較及不同基因型對(duì)IL-33水平的影響

討 論

IL-33位于人類第9號(hào)染色體上，編碼270個(gè)氨基酸，是一種多態(tài)性細(xì)胞因子[5]，在機(jī)體內(nèi)有雙重作用模式，對(duì)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)維持和對(duì)外界環(huán)境變化的應(yīng)答十分重要。云南宣威地區(qū)是我國(guó)肺癌的點(diǎn)狀高發(fā)區(qū)，研究當(dāng)?shù)胤伟┌l(fā)病機(jī)制已成為熱點(diǎn)和難點(diǎn)。探究IL-33基因多態(tài)性及其血清水平與宣威肺癌的關(guān)系，可為宣威肺癌的分子生物學(xué)角度來(lái)分析該疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸，為臨床治療提供參考。

IL-33是一種前炎性細(xì)胞因子，可結(jié)合白介素1(interleukin 1,IL-1)受體家族成員孤兒受體 ST2，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞的生成，介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)[6]。IL-33還是一種“預(yù)警因子”，細(xì)胞壞死時(shí)，IL-33可從細(xì)胞核中釋放，進(jìn)而刺激多種炎癥因子參與免疫調(diào)控[7]。IL-33基因多態(tài)性的分布特點(diǎn)因地域、種族、環(huán)境、自然等存在著很大差異[8]。本研究發(fā)現(xiàn)云南宣威人IL-33基因rs10975521位點(diǎn)分別為AA、GA、GG三種，頻率分別為19.00%、48.00%、33.00%，通過(guò)與1000Genomes數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果比較，也發(fā)現(xiàn)IL-33基因rs10975521位點(diǎn)無(wú)論是基因型還是等位基因頻率，與不同種族、不同地區(qū)人群均存在差別。基因多態(tài)性是一種普遍存在的現(xiàn)象，這種突變與環(huán)境有很大關(guān)系。宣威地區(qū)地處云南東北部, 擁有豐富的煤炭資源，大多數(shù)宣威居民在通風(fēng)不良的家中燒黑煙(煙煤)做飯、取暖，整個(gè)生活過(guò)程都暴露在極高水平的多環(huán)芳烴(PAHs)下，這可能也是宣威人高發(fā)肺癌的關(guān)鍵因素。有研究表明，IL-33在胃癌、乳腺癌等多種系統(tǒng)腫瘤中起關(guān)鍵性炎癥因子作用，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[9-12]。本研究對(duì)IL-33基因多態(tài)性與云南宣威肺癌的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肺癌組在IL-33基因rs10975521位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的分布和對(duì)照組之間的比較有顯著性差異，攜帶AA基因型與增加肺癌風(fēng)險(xiǎn)具有顯著的相關(guān)性，其中A等位基因型發(fā)生肺癌風(fēng)險(xiǎn)是G等位基因型的1.35倍。可能是炎癥環(huán)境介導(dǎo)IL-33釋放, 由此經(jīng)IL-33基因多態(tài)性rs10975521位點(diǎn)及ST2受體和其下游信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Mousas A等[13]研究表明，IL-33基因rs146597587與嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少存在關(guān)系。這可能解釋了炎癥介導(dǎo)IL-33釋放。

IL-33可通過(guò)調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的分化，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子的釋放，加重機(jī)體炎癥反應(yīng)，促使肺癌患者的肺功能下降。大量研究報(bào)道，IL-33在多種慢性炎癥(如肝纖維化、炎癥性腸病等)及癌前病變(如宮頸上皮內(nèi)瘤變、腸腺瘤等)均呈高表達(dá)[14-16]。均提示了IL-33可能在炎癥向腫瘤發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Hu等[17]研究證實(shí)非小細(xì)胞肺癌病人血清中較高的IL-33水平與不良預(yù)后有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組的血清IL-33表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與Kim等[18]研究報(bào)道肺癌病人血清中IL-33表達(dá)水平高于正常人的結(jié)果相符，表明肺癌的發(fā)生發(fā)展與IL-33的介導(dǎo)有關(guān)。其原因分析：IL-33與其受體ST2結(jié)合，刺激下游信號(hào)分子聚集，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞IL-1、IL-8分泌，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致Th1/Th2失衡。而Th1/Th2失衡可誘發(fā)肺癌[19-21]。因此，血清IL-33表達(dá)也屬于誘導(dǎo)型。本研究還發(fā)現(xiàn)在IL-33基因rs10975521的AA、GA、GG基因型中，肺癌組的三種不同基因型之間血清IL-33表達(dá)水平比較有差異，且血清IL-33表達(dá)水平在rs10975521的AA、GA、GG基因型為AA>GA>GG。rs1929992-AA位于IL-33基因內(nèi)含子區(qū)，不太可能改變蛋白質(zhì)的核心構(gòu)象，但可能影響其與受體結(jié)合的親和力，當(dāng)rs1929992突變表現(xiàn)為AA基因型時(shí)，其位點(diǎn)的突變對(duì)轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生了影響，同時(shí)也影響基因調(diào)控和功能[22], 導(dǎo)致rs10975521位點(diǎn)表現(xiàn)為AA時(shí)肺癌易感性高。血清IL-33表達(dá)是誘導(dǎo)型，rs10975521位點(diǎn)表現(xiàn)為AA增加肺癌易感性，肺部正常細(xì)胞壞死，會(huì)增高血清IL-33表達(dá)水平，因?yàn)镮L-33可在壞死細(xì)胞核中釋放出。這也提示了肺癌患者血清IL-33高表達(dá)水平很可能是受rs10975521位點(diǎn)表現(xiàn)為AA基因型的介導(dǎo)。

綜上所述，IL-33基因rs10975521位點(diǎn)多態(tài)性與云南宣威肺癌易感性具有相關(guān)性，其中rs10975521位點(diǎn)表現(xiàn)為AA時(shí)可促進(jìn)血清IL-33的高表達(dá)，與云南宣威肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。

本研究因局限的實(shí)驗(yàn)樣本量，結(jié)果可能存在一定偏倚，仍需更大的樣本量來(lái)進(jìn)一步佐證。