鼠類脊柱側凸動物模型研究進展

趙彬，李凱，薛旭紅，趙勝

(1.山西醫(yī)科大學，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院骨科，山西 太原 030001)

脊柱側凸是指脊柱椎體向側方移位并伴有椎體旋轉的三維結構性畸形。國際脊柱側凸研究協(xié)會定義脊柱側凸為測量全脊柱正側位X線片Cobb角>10°[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球青少年脊柱側凸的發(fā)病率為1%～3%[2]。該疾病的發(fā)生可涉及多種因素，相關的病因學機制及遺傳背景尚未明確。為研究該疾病的具體發(fā)病機制而進行人類隨機對照試驗不符合相關的醫(yī)學倫理學要求[3]，動物模型便成為了研究其病因學及遺傳學的重要工具，合適的脊柱側凸動物模型對研究人員及臨床醫(yī)生深入研究該疾病的病因及病理方面有重大意義。

迄今為止，已通過各種誘導方式成功構建了雞、兔子、青蛙、豬、山羊、綿羊及靈長類動物的脊柱側凸模型[4]。但相關研究表明：鼠類作為經典的脊椎類哺乳動物與人類的基因組高度相似[5]；人類已經可以成功改變小鼠基因組類型，構建各種基因修飾、敲除模型；兩足大鼠和小鼠在不同的模型中脊柱側凸發(fā)生率明顯高于其他動物[6]；鼠類脊柱側凸模型可以較好的反映出與疾病相關的病理過程[1-6]。此外，由于鼠類操作簡單、成本較低、繁殖周期快等特性可以在短期內產生大量的數(shù)據(jù)樣本[7]，目前已成為研究脊柱側凸相關問題的有力工具。本文將分別對先天性脊柱側凸(congenital scoliosis，CS)和特發(fā)性脊柱側凸(idiopathic scoliosis，IS)近年來常用的鼠類動物模型作一綜述。

1 先天性脊柱側凸(congenital scoliosis，CS)

CS是指母體妊娠期4～6周內，由于脊柱先天性發(fā)育異常引起椎體畸形或分割失敗而導致脊柱矢狀位排列紊亂[8]。據(jù)統(tǒng)計，新生嬰兒CS的發(fā)病率為0.5%～1.0%[9]。目前較常用的鼠類CS動物模型有以下兩種。

1.1 妊娠期雌鼠暴露于一氧化碳(CO)環(huán)境中構建CS模型 相關研究已證實：CO環(huán)境因素對孕婦、胎兒、新生嬰兒有一定的生物學致畸作用[10]，CO在機體內與氧競爭血紅蛋白結合位點，干擾組織氧合作用。母體在懷孕期間暴露于CO環(huán)境中，CO可通過胎盤作用于胎兒組織從而導致胎兒椎體發(fā)生異常。Loder等[11]選用DBA-1J系雌性小鼠，將懷孕的雌鼠暴露于200、400、600ppmCO環(huán)境中，新生幼鼠行脊柱X線檢查觀察先天性脊柱畸形，統(tǒng)計結果表明在600ppmCO環(huán)境中脊柱畸形發(fā)生率為77%。并在雌鼠妊娠21天周期內的不同時期分組暴露于600ppmCO環(huán)境中7h，結果雌鼠妊娠期內易受CO環(huán)境影響的時期為第9.5天。Farley等[12]在Loder等的研究基礎上，追蹤CO環(huán)境下產生的先天性脊柱畸形幼鼠脊柱側凸的發(fā)展；選用DBA-1J系雌鼠在妊娠期第9.5天持續(xù)暴露于600ppmCO環(huán)境下，幼鼠出生后第42、54、61天對其進行影像學檢查以及病理切片觀察組織學形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在去除母鼠同類相食、流產、死產等影響因素后存活的31個后代中55%發(fā)生脊柱側凸。上述研究證明了CO環(huán)境下新生幼鼠的先天性脊柱畸形會隨生長發(fā)育成為CS。小鼠與人類發(fā)育曲線的平行性使得該動物模型對CS的研究起到了重要作用，但未來的研究中需要繼續(xù)探索CO環(huán)境暴露下發(fā)生CS的具體病理機制。

1.2 雌鼠妊娠期維生素A缺乏(vitamin A deficient，VAD)構建CS模型 視黃酸(retinoic acid，RA)是一種活性維生素A，在細胞分化、骨軟骨發(fā)育等過程中起重要作用[13]。維生素A轉化為胚胎RA受到視黃醛脫氫酶(retinal dehydrogenase，RALDH)的嚴格調控[14]。在脊椎動物的進化過程中RA由(RALDH1、RALDH2、RALDH3)三種RALDH合成，還可通過視黃酸受體(retinoic acid receptor，RAR)途徑對胚胎產生影響[15]。Li等[16]隨機將32只雌性Wistar大鼠分為對照組(常規(guī)飲食)和實驗組(交配前給予VAD飲食，分娩后恢復常規(guī))。新生大鼠2周齡后行全脊柱X線檢查評估脊柱畸形的發(fā)生率，通過反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術評估RALDH和RAR在椎體及肝臟中的表達。結果表明：VAD組新生大鼠CS發(fā)生率為13.79%，對照組CS發(fā)生率為0%；VAD新生大鼠在頸部、胸部、骨盆、骶尾部及四肢區(qū)域出現(xiàn)明顯骨骼畸形。VAD可負調節(jié)肝臟細胞及椎體中RALDH1、RALDH2、RALDH3、RAR的mRNA表達水平。Chen等[17]研究提出，內源競爭性RNA(competitive endogenousRNA，ceRNA)調控網絡在CS的發(fā)病機制中起重要作用，對VAD誘導的CS形成過程中的ceRNA機制進行全面的研究，為VAD-CS的診療提供新方式。Chen在Li等[16]的VAD-CS模型基礎上，隨機將20只SD雌性大鼠分為VAD實驗組和正常對照組，造模方法同上，妊娠第9天收集兩組的胚胎進行基因測序分析ceRNA調控網絡。提供了CS中的ceRNA數(shù)據(jù)整合分析以及非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)的綜合表達譜，全面鑒定了VAD-CS中胚胎體節(jié)發(fā)育的ceRNA調控網絡。以上研究說明了母體VAD癥可導致子代發(fā)生CS，之后應進一步探索更加全面的蛋白質組學及相關的信號傳導途徑。

2 特發(fā)性脊柱側凸(idiopathic scoliosis，IS)

IS主要表現(xiàn)為椎體的水平面旋轉、冠狀面彎曲、矢狀面異常排列的逐漸加重，約占脊柱側凸病例的84%～89%[18]。在診斷前需排除由先天性、感染性、神經肌肉疾病以及椎管內異常等[19]原因導致的側凸。IS的病因學研究包括了遺傳、環(huán)境、代謝、激素、生化等[20]多個方面。目前較常見的IS鼠類模型包括下列幾種。

2.1 增強中樞瘦素(leptin，LP)活性構建雙足小鼠IS模型 LP是脂肪組織分泌的一種蛋白質類激素，對青春期下丘腦垂體系統(tǒng)、能量消耗、體重指數(shù)、骨代謝等[21]方面有一定的調節(jié)作用。Tam等[22]發(fā)現(xiàn)青少年特發(fā)性脊柱側凸(adolescent idiopathic scoliosis，AIS)患者血清LP水平降低，LP功能障礙可能在AIS的發(fā)生發(fā)展中起相關作用。由于小鼠在LP作用系統(tǒng)方面與人類相似，所以常被用來研究LP的相關生理作用[23]。Wu等[24]將50只3周齡C3H/Hej雄性小鼠行雙前肢截骨，術后隨機分為兩組各25只，A組下丘腦注射過量表達的LP慢病毒載體，B組注射對照慢病毒載體。保持小鼠雙足直立姿勢繼續(xù)喂養(yǎng)，監(jiān)測生長狀態(tài)。20周后行X線檢查，記錄各組小鼠脊柱側凸發(fā)生率、Cobb角大小及循環(huán)血清LP含量，并進行統(tǒng)計學分析。結果顯示：A組LP過量表達的小鼠IS發(fā)生率92%、Cobb角平均30.2°、循環(huán)血清中的瘦素含量明顯高于B組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義。該方法成功構建了雙足小鼠IS模型，并證明了中樞LP活性增強可增加IS的發(fā)病風險并促進疾病的進展。但該模型與人類AIS患者仍有部分差異：A組LP過量表達的小鼠血清中LP含量升高，與AIS患者相反；A組小鼠體重在20周后與對照組無差異，與AIS患者常表現(xiàn)為體重較正常人減低不符。所以有關中樞LP活性增強可導致IS發(fā)生的具體病理機制需進一步的研究。

2.2 利用體內褪黑素含量減少構建IS模型 褪黑素又稱N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是由下丘腦內松果體分泌的一種胺類激素[25]。Thillard[26]在1959年通過切除兩足雞的松果體建立了與褪黑素含量減少相關聯(lián)的脊柱側凸動物模型，之后為研究褪黑素在IS發(fā)病過程中的作用，建立了各種誘導褪黑素減少導致IS的動物模型，其中使用最多的動物模型就是哺乳動物大鼠。Machida等[27]隨機將45只雄性SD大鼠分組，10只四足大鼠松果體切除，20只雙足大鼠松果體切除，10只雙足大鼠松果體切除后植入褪黑素顆粒，5只雙足大鼠行松果體假切除術。繼續(xù)喂養(yǎng)3個月后對大鼠行脊柱X線檢查，結果顯示脊柱側凸只出現(xiàn)在松果體切除后的雙足大鼠中，其余三組只有1只出現(xiàn)。該研究表明與人類相似的雙足站立姿勢和脊柱軸向負荷機制對脊柱側凸的發(fā)展有重要作用。Machida等[28]在之后的相似實驗中指出，雙足大鼠松果體切除術后褪黑素缺乏所導致的平衡功能紊亂和雙足站立姿勢可促進IS的發(fā)展，但松果體切除為該模型的必要條件。相關研究發(fā)現(xiàn)：比較各類近交系鼠，C57BL/6J小鼠的骨密度最低，因此該品系小鼠成為評價體內褪黑素對骨形成影響的最佳選擇[29]。Machida等[30]使用C57BL/6J小鼠進行實驗，并將切除松果體的部分C57BL/6J雙足小鼠中每日規(guī)律注射褪黑素8mg/kg，5個月之后行全脊柱X線和三維CT檢查小鼠脊柱。發(fā)現(xiàn)切除松果體導致褪黑素缺乏癥的C57BL/6J雙足小鼠幾乎全部發(fā)生脊柱側凸，而每日注射褪黑素治療的C57BL/6J雙足小鼠未發(fā)生脊柱側凸。該實驗證明，通過外源性的褪黑素注射療法可以有效預防脊柱側凸的發(fā)生與發(fā)展。另有研究指出，IS患者體內褪黑素水平明顯低于同齡健康個體，表明褪黑素水平的減低與IS的發(fā)生有明顯相關性[31]。但該造模方法存在實驗成本高、耗時長、手術難度大、實驗鼠死亡率高等明顯不足[32]，因此之后的IS模型開始利用褪黑素拮抗劑抑制其在機體內的作用。Yang等[32]的實驗隨機將60只大鼠分三組，每組20只，A、B組在麻醉后行雙側前肢及尾骨近端截骨術構建雙足大鼠模型，A、C組腹腔注射美國Sigma公司生產的褪黑素拮抗試劑Luzindole，注射劑量為0.2mg/kg。術后1個月、3個月、6個月分別對存活的大鼠行X線檢查并測量Cobb角。實驗結果顯示：術后1個月時A、B兩組的脊柱側凸發(fā)生率無明顯差異，術后3個月及6個月時A組脊柱側凸發(fā)生率及Cobb角度數(shù)明顯高于B組，C組在整個過程中未出現(xiàn)脊柱側凸，該結果均有統(tǒng)計學意義。C組大鼠未出現(xiàn)脊柱側凸說明注射褪黑素拮抗劑可增加脊柱側凸的發(fā)病率，但單純的褪黑素抑制或缺乏不足以發(fā)生脊柱側凸，褪黑素水平降低在脊柱側凸發(fā)病過程中只發(fā)揮協(xié)同作用。該結論在Wu等[33]的實驗中也被證實。盡管利用褪黑素缺乏可成功構建IS模型，但褪黑素水平降低并非發(fā)生脊柱側凸的決定性因素。褪黑素相關的通路功能障礙及在人類IS發(fā)病過程中的具體作用尚未明確，且該模型體積較小，無法進行相應的臨床治療方面的研究。

2.3 改變大腦運動皮質相關信號的調控作用構建IS模型 站立時與身體姿勢保持平衡相關的腦干組織受損后可導致脊柱側凸[34]。姿勢反射由本體感覺傳入調節(jié)，感覺運動處理異常或出現(xiàn)缺陷可導致姿勢張力受損，從而引起脊柱畸形。感覺傳入系統(tǒng)的改變可對肌張力障礙性疾病有一定影響[35]，因此單側的軸向肌張力障礙引起的異常感覺運動與IS相關的骨骼改變有關。檢測IS部分患者的軀體感覺誘發(fā)電位可發(fā)現(xiàn)腦皮層中N-37誘發(fā)電位出現(xiàn)選擇性延遲現(xiàn)象，可能是由于本體感覺傳入系統(tǒng)的皮質處理功能失調引起[36]。Domenech等[37]將50只Wistar大鼠隨機分為皮質切除組24只(大腦右半球行開顱及右側皮質電凝術)，假手術組16只(只開顱不破壞右側皮質)，無干預對照組10只。術后1個月利用雙脈沖電刺激并記錄運動誘發(fā)電位、肌電圖，術后3個月行X線檢查，Cobb法測量脊柱畸形程度。結果顯示：假手術組及對照組對雙脈沖電刺激反應無差異、未出現(xiàn)脊柱側凸大鼠；手術組大鼠右半球興奮性明顯增強、左右半球明顯不對稱，46%的大鼠出現(xiàn)脊柱側凸畸形，平均Cobb角23°。通過該方法成功構建了IS模型證明了脊柱側凸與皮質區(qū)興奮性增強、感覺運動障礙有關。兩個半球間運動興奮性不對稱所引起的肌張力障礙可對生長發(fā)育過程中的脊柱造成一定影響，促進脊柱側凸的發(fā)展。

2.4 無創(chuàng)方法誘導下構建IS模型 Silva等[38]提出侵入性方法構建IS模型的實驗動物死亡率高、耗時長，易造成脊柱周圍細胞組織的改變，建議開發(fā)一種不干擾脊柱周圍組織的方法誘導IS模型。Silva將24只雄性Wistar大鼠隨機分為兩組，每組各12只。實驗組4周齡起佩戴由聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)材料制作的背心(邊緣由合成樹脂覆蓋避免大鼠皮膚破損以及呼吸、移動受限)，持續(xù)12周。每周調整、更換PVC背心，以發(fā)展為左凸性脊柱側凸模型。每周對大鼠進行1次全脊柱X線檢查并測量Cobb角。統(tǒng)計分析證明：佩戴PVC背心6周后，已成功構建永久性脊柱側凸模型[Cobb角(28±5)°]。隨后收集其腹部、肋間、椎旁和兩側胸肌測定肌糖原含量，利用放射免疫法測定血漿中胰島素含量。肌糖原是機體內重要的能源物質，過度消耗會導致機體疲勞并參與肌層肥大[39]。胰島素在調節(jié)碳水化合物和骨骼肌相關激素代謝過程中有重要作用[40]。測定結果顯示：與對照組相比，發(fā)生IS的大鼠腹部肌肉、肋間肌、椎旁肌、胸肌肌糖原儲備量各減低13%、40%、20%、28%。IS大鼠的胰島素敏感性較正常對照組下降18%。Silva成功的利用無創(chuàng)誘導法構建了穩(wěn)定的IS模型，發(fā)現(xiàn)了該模型中肌糖原及胰島素敏感性的變化，但該現(xiàn)象與脊柱側凸發(fā)病過程的相關生理關系仍需進一步研究分析。

綜上所述，雖然目前針對先天性脊柱側凸、特發(fā)性脊柱側凸的手術治療規(guī)范與指南已較為成熟，但在疾病的早期預防、早期干預和病因研究方面有待進一步發(fā)展。從解剖學、生物力學等角度來講，動物模型雖不能完全復制人類的脊柱結構及生理狀態(tài)，但對于疾病的病因學及遺傳學方面有重要意義，為此各國學者成功構建了各種類型的鼠類脊柱側凸動物模型。以動物模型為基礎的實驗研究已成功揭示了多種脊柱側凸的相關發(fā)病機制，但是距離闡明該疾病病因的最終目標仍有一定的距離。我們相信利用更加科學的動物模型針對脊柱側凸進行深入的探索研究，會為將來該疾病的一級預防、發(fā)病率控制和臨床治療方面提供更有效的方法與思路。