影響非洲豬瘟病毒核酸檢測結果準確性的關鍵技術

鄭梅紅

（舞鋼市動物疫病預防控制中心，河南 舞鋼 462500）

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染導致的一種急性、熱性、高度接觸性烈性傳染病，雖不屬于人畜共患，但一旦發(fā)生，對養(yǎng)豬業(yè)的影響幾乎是滅頂之災。非洲豬瘟實驗室病毒核酸檢測是一種簡單、快捷的病原學檢測方法，但由于病毒核酸檢測對環(huán)境和操作過程要求十分嚴格，所以為了提高非洲豬瘟病毒核酸檢測結果的準確性，對非洲豬瘟病毒核酸進行檢測時，檢測員必須認真對待每一個操作細節(jié)。筆者根據(jù)多年來的實驗室檢測經驗并結合部分參考文獻，整理歸納，總結出了影響實驗室非洲豬瘟病毒核酸檢測準確性的幾個要點。

1 非洲豬瘟病毒核酸檢測的重要性

1.1 非洲豬瘟病毒的性質

非洲豬瘟（ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）感染導致的一種急性、熱性、高度接觸性烈性傳染病，發(fā)病時間短（2～21 d）、發(fā)病率和死亡率95%以上，有時甚至可達到100%，由此我國將此病列為一類動物疫病。其病毒基因型多（24個基因型、9個血清型），易突變，導致病毒存活時間久（25～37 ℃存活數(shù)月，4℃存活1年以上，冷凍或者腌肉可以達數(shù)年至數(shù)十年）、抵抗力強（耐酸堿pH 4-10時也很穩(wěn)定、反復凍融不影響病毒活力），很多臨床癥狀和普通豬瘟非常相似，到目前為止還沒有有效的疫苗和藥物來阻止病毒的侵襲，依靠實驗室檢測才能對其進行確診。

1.2 非洲豬瘟病毒核酸檢測技術的發(fā)展及其重要性

非洲豬瘟實驗室檢測方法雖然理論上有多種，但由于影響因素太多，有些操作起來非常困難，常常導致試驗失?。挥行┓磻獣r間太長，滿足不了急需。這兩年隨著先進儀器的生產，檢測技術的提升，對非洲豬瘟的檢測無論從結果的精準度和檢測時間的縮短上都提高了很多。目前非洲豬瘟病毒核酸檢測是診斷非洲豬瘟的重要措施之一，其準確率幾乎達到100%，方法簡單快捷。以鄭州某生物技術有限公司生產的病毒DNA/RNA提取試劑盒為例，操作過程也僅僅只需30 多分鐘，然后放入PCR 分析儀再進行讀取結果，縣級實驗室和條件好一點的養(yǎng)殖場都可以開展。如發(fā)現(xiàn)疑似就近立即進行非洲豬瘟病毒檢測，這也是迅速控制非洲豬瘟擴散和傳播最關鍵的一步。但由于這種檢測方法靈敏度高、特異性高，受外界影響因素復雜，所以在檢測過程中有許多細節(jié)必須注意，絕不能掉以輕心。做好實驗室檢測，早發(fā)現(xiàn)早處理，嚴禁病毒進一步擴散，這也是我們獸醫(yī)工作者的艱巨任務。

2 檢測時細節(jié)的注意事項

下面以實驗室最常用的熒光PCR 檢測方法為例，結合筆者多年來的實驗室檢測經驗，并結合部分參考文獻，以操作過程中可能會出現(xiàn)影響結果準確性的一些因素以及如何避免這些問題，總結出以下幾條影響非洲豬瘟病毒核酸檢測結果準確性的關鍵技術。

2.1 樣品處理和保存

全血、血清和血漿可直接進行下一步試驗，淋巴結、脾臟、扁桃體、肌肉等組織需加生理鹽水或者PBS 液進行研磨。研磨不能用金屬轉頭，研磨時必須研細均勻，研磨組織不能過大，以免雜質含量過高而抑制后續(xù)的PCR 反應，然后離心抽取上清液進行檢測。樣品混樣時，一孔內盡量是同一圈舍的樣品，或者是一個豬場的樣品。一孔內樣品份數(shù)不能太多（也有專家說一孔最多不能超過32 份）。如果樣品加樣量不夠，可以添加一些生理鹽水或者PBS 液再抽取，不然加樣量不準確也會影響試驗結果的準確性。為避免病毒RNA/DNA 降解，提取后的樣品應立即進行檢測，不然會產生假陰性。不能立即檢測的，如在2 h 內檢測，應置于4 ℃環(huán)境中，3 個月內檢測應置于-20 ℃以下冰箱內保存，如果長期保存應置于-70℃以下。避免樣品反復凍融。非洲豬瘟病毒檢測時樣品最好現(xiàn)提取現(xiàn)用。

經裂解處理的樣品，不能用于樣品保存，僅用于即時檢測。

2.2 樣品的滅活

試驗前對樣品在水浴鍋內經過60 ℃30 min 的滅活處理，可有效殺滅樣品內非洲豬瘟病毒的感染力，并保持其活力，也能有效殺滅其他病毒的特異性，不至于影響試驗效果。

2.3 檢測試劑的正確保管和使用

檢測試劑必須嚴格按試劑盒說明要求的溫度保存；嚴禁使用超過有效期的試劑；不同批號的試劑勿混用；避免試劑長時間打開。

實驗前先拿出所需試劑，試劑溶化或者恢復室溫后，根據(jù)試劑說明書，充分混勻所需試劑，同時注意避免混勻時用力過猛，產生氣泡；PCR 反應體系對光和溫度特別敏感，保存和使用時外面要裹上一層不透明的錫紙，加PCR 反應體系時，不要開啟生物安全柜內的燈光；使用時拿出冰箱，溶化后方可正常使用，使用后再立即放入冰箱冷凍。反應體系和陰陽對照凍融次數(shù)越少越好（最好不要超過3 次），保質期最好不要超過半年，反復凍融易失活。

2.4 實驗室檢測區(qū)域必須確保無菌狀態(tài)

檢測前檢測區(qū)域及空間和實驗臺面都要進行一次徹底消毒和清潔。結束后仍要及時對臺面進行消毒和清潔。生物安全柜先通風10 min 以抽出污染的氣溶膠，然后用紫外線消毒30 min 以上再使用。生物安全柜要合理分區(qū):潔凈區(qū)（左手邊放置槍頭、PCR 反應管等）；實驗操作區(qū)；污染區(qū)（右手邊放置廢液缸、10% 84 消毒液等）。加樣過程必須在經過消毒處理過的生物安全柜內進行，同時開啟排風系統(tǒng)。整個試驗過程中實驗室門必須時刻保持關閉狀態(tài)。這是為成功的試驗負責，也是為自身生物安全負責。

2.5 各實驗區(qū)、器材、耗材不能交叉使用

病毒核酸提取試劑盒提取靶標為病毒RNA/DNA,操作過程特別要防止RNA 或者DNA 的降解，所有使用的器皿、加樣器均為專用。病原學檢測各區(qū)域均為專用。各檢測室之間運送物品必須經傳遞窗口傳送，并且不得回流。離心管、槍頭等一次性耗材，用前需進行高壓滅菌。操作人員應戴無粉手套。加入反應體系和加入核酸提取液分別在兩個不同的生物安全柜內進行。生物安全柜內不要過載，整個實驗過程中所需物品都要在工作前放入，并且廢棄物缸要遠離其他物品。

2.6 核酸提取時不能有任何污染

提取病毒核酸時，儀器必須先經紫外線照射30 min以上，進行消毒和滅菌。核酸提取時不能有任何病菌，特別是豬瘟陽性病毒的污染，不然會嚴重影響試驗結果的準確性。核酸提取結束后，拿取吸附棒時動作一定要輕微，免得各孔相互污染。如果采集和制備過程中發(fā)生交叉污染，則容易出現(xiàn)假陽性。PCR 反應管進行加樣時，按照陰性對照、待檢樣品、陽性對照的順序加入，如果把陽性對照放在前面，檢測時會存在受陽性污染的風險。為防止熒光的干擾，要使用不含熒光物質的一次性手套，避免用手直接接觸，請勿在PCR 反應管上標記。同時吸取核酸提取液時，盡量避免吸取磁珠。

上機前注意檢查PCR 反應管是否蓋緊，以免熒光物質泄漏污染儀器。

2.7 加樣量必須確保準確

提取病毒核酸時，一定要按照說明書上的指定孔準確加量。特別是向PCR 反應管加入檢測樣品、陰陽對照，由于加樣量很小，吸取后一定要再次確認有無吸取以及吸取容量，加入時吹打動作一定要干脆麻利，吹打干凈，打入時避免產生氣泡。完全加樣后瞬時離心，讓加樣物全部沉入孔底，避免PCR 反應管放入PCR 分析儀讀取結果時出現(xiàn)誤差。

2.8 必須做好自我防護

整個試驗過程中必須穿上防護服、一次性手套（無粉塵不含熒光物質）、口罩、帽子、鞋套、護目鏡，一旦發(fā)現(xiàn)有污染風險，必須更換。試驗過程中絕不能在無菌室內從事任何無關試驗的活動。用過的廢棄物及時進行歸類滅菌處理。

2.9 廢棄物應及時處理

因檢測的樣本可能含有病毒，雖然經過試劑裂解后一般無生物污染性，但仍需要按照有生物污染性對待，使用過的試劑預裝板及攪拌棒要及時安全棄置。采樣所用器械及檢測過程中產生的廢棄物應及時歸類高壓滅菌處理。檢測過程中用過的吸頭應直接打到盛有10%的巴氏消毒液或者0.8%的氫氧化鈉溶液的帶蓋的廢棄物缸中。反應后的PCR 反應管嚴禁開蓋和高壓處理。實驗室內已耗材料和儀器未經處理不得移出。

3 總結

病原學檢測對試驗環(huán)境和試驗操作的要求非常嚴格，每一步都必須嚴格按照試劑盒說明書上的要求進行操作。對試劑的保管也必須按各自的要求放在合適的溫度環(huán)境中。影響檢測結果的每一個技術關鍵必須牢記在心。試驗過程中如發(fā)現(xiàn)問題立即上報，以便快捷、妥善處理。