石蠟切片操作規(guī)范性的進(jìn)展研究

河南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 國(guó)家藥監(jiān)局醫(yī)用生物防護(hù)及植入器械質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（450000）陳國(guó)銘 周靜 田林奇 魏聰 周小婷 何孜翰 柳小軍

一張良好HE染色切片，是教學(xué)、科研以及病理診斷中不可缺少一項(xiàng)環(huán)節(jié)[1]。隨著病理技術(shù)快速發(fā)展，新設(shè)備問(wèn)世極大減少了病理技術(shù)相關(guān)工作者手工操作，且新技術(shù)應(yīng)用充實(shí)病理診斷方式，提高診斷準(zhǔn)確性，但最常規(guī)、最重要、最基礎(chǔ)仍舊為石蠟切片技術(shù)[2]。石蠟切片技術(shù)屬于臨床中常見(jiàn)的制片技術(shù)，其應(yīng)用在正常組織細(xì)胞觀察，同時(shí)廣泛應(yīng)用至病理學(xué)研究以及疾病診斷等多個(gè)方面，存在成本低、保存時(shí)間長(zhǎng)以及直觀性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)[3][4]。石蠟切片技術(shù)是醫(yī)學(xué)生在學(xué)習(xí)組織學(xué)中必須掌握的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可對(duì)學(xué)生后期從事病理診斷、檢驗(yàn)技術(shù)等多個(gè)工作打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。石蠟切片制作過(guò)程具體為取材、固定、脫水以及透明、浸蠟、包埋等步驟[5]。筆者結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)、體會(huì)，對(duì)石蠟切片的制作過(guò)程中部分措施予以改善，同時(shí)總結(jié)制作期間注意事項(xiàng)。

1 甲級(jí)組織脫水、HE染色、石蠟切片標(biāo)準(zhǔn)

1.1 組織脫水、包埋后優(yōu)質(zhì)蠟塊標(biāo)準(zhǔn) 無(wú)凹陷、混濁；組織無(wú)缺損、斜坡；無(wú)氣泡、白點(diǎn)。

1.2 優(yōu)質(zhì)切片標(biāo)準(zhǔn) 切片厚薄適度且無(wú)缺損；不掉片、無(wú)裂紋、無(wú)刀痕、無(wú)皺褶；無(wú)氣泡且撈片位正。

1.3 優(yōu)質(zhì)HE染色標(biāo)準(zhǔn) 著色適中且色澤鮮艷；染色質(zhì)為顆粒狀，且清晰透明；封片無(wú)溢膠、切片無(wú)污染，且無(wú)氣泡；編號(hào)正確、位正、標(biāo)簽清晰。

2 取材、固定

2.1 流程如下 ①結(jié)合實(shí)際要求選擇動(dòng)植物材料；結(jié)合具體要求將組織切為小塊，一般為5mm×5mm×2mm，分別對(duì)應(yīng)長(zhǎng)、寬、高；②將切好組織塊投至濃度為4%多聚甲醛溶液內(nèi)予以固定，固定時(shí)間為24h左右。

2.2 注意事項(xiàng)具體如下 ①取材新鮮，部位準(zhǔn)確；②一次性完成切割組織，切勿擠壓組織；③保持取材組織表面潔凈，不應(yīng)有毛發(fā)、血液等；④于使用前現(xiàn)配固定液，且確保量充足；⑤組織若無(wú)法得到充分固定，制作完成切片隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)自溶、腐敗等狀況。鑒于此，于固定時(shí)可于瓶底放置幾層紗布避免組織和瓶底出現(xiàn)直接性接觸，確保固定液由各個(gè)角度均勻滲入至組織內(nèi)部；⑥針對(duì)較為柔軟的器官，固定時(shí)若僅單純整個(gè)放置于固定液內(nèi)，固定用時(shí)較長(zhǎng)，且若器官相對(duì)較大，可能導(dǎo)致內(nèi)部固定不全或者不充分等不良結(jié)果，故可先將大塊組織投至固定液內(nèi)固定，待2～3h后組織出現(xiàn)硬化后，將大塊組織切為小塊，后將小塊組織再投至固定液內(nèi)。

3 脫水、透明

3.1 流程如下 ①組織塊在固定24h后，取出并經(jīng)自來(lái)水予以沖洗，然后分別使用30%、50%、70%、85%以及95%乙醇溶液對(duì)組織塊實(shí)施脫水處理，每次處理時(shí)間約30min，最后經(jīng)無(wú)水乙醇對(duì)組織塊進(jìn)行脫水3次，每次1h；②組織透明時(shí)選用二甲苯作透明劑，首先將脫水后組織放至二甲苯與無(wú)水乙醇各半混合液內(nèi)，于1h后轉(zhuǎn)入到二甲苯內(nèi)浸漬。

3.2 注意事項(xiàng)具體如下 ①乙醇具有較強(qiáng)揮發(fā)性，應(yīng)在組織脫水之前進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)配制，且于脫水前與脫水期間將裝有乙醇溶液容器封閉；②逐步進(jìn)行組織脫水步驟，不可直接性由高濃度乙醇開始，此外，組織在乙醇溶液內(nèi)不宜浸泡過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，否則可產(chǎn)生過(guò)度脫水狀況，引起組織硬脆、收縮；③待組織浸泡至二甲苯之后，若產(chǎn)生白色云霧狀現(xiàn)象，說(shuō)明組織尚未完全脫水，需要重新脫水；④嚴(yán)格控制組織浸入二甲苯時(shí)間，若時(shí)間過(guò)短可致使組織透明不夠徹底，導(dǎo)致后期難以浸入石蠟，相反，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可致使組織硬脆，切片為“豆腐渣”樣；⑤二甲苯具有較強(qiáng)揮發(fā)性，且存在毒性，故在組織透明期間應(yīng)于通風(fēng)窗口處實(shí)施；⑥脫水時(shí)，可先用濾紙吸收組織塊周圍水分，后再將組織塊放置乙醇溶液中，可提高脫水效率；⑦在透明期間，可先用紗布包裹組織，后浸至二甲苯中，待進(jìn)入后，應(yīng)用載玻璃片壓在其上方，以確保組織完全浸入至透明劑中。

4 浸蠟、包埋

4.1 流程如下 浸蠟?zāi)康臑槭灲胫两M織內(nèi)取代透明劑，與此同時(shí)對(duì)組織發(fā)揮支持效果。①將組織浸入至已融化石蠟與二甲苯等量混合液內(nèi)，于1h后將組織先后移至2個(gè)熔化純石蠟液浸漬3h；②取出組織塊，切面朝下放置在手工小紙盒內(nèi)，后加滿石蠟實(shí)施包埋。

4.2 注意事項(xiàng)具體如下 ①如果浸蠟液應(yīng)用舊蠟與新蠟混合液，新蠟加入量最好≤舊蠟1/3，且應(yīng)反復(fù)實(shí)施高溫熔化以排出新蠟內(nèi)氣體；②浸蠟溫度最好≤65℃，否則過(guò)高溫度可將組織內(nèi)抗原破壞，影響病理診斷結(jié)果；③需結(jié)合組織塊大小、種類等嚴(yán)格把控浸蠟時(shí)長(zhǎng)，如果時(shí)間過(guò)短，可致使石蠟無(wú)法完全浸入組織，導(dǎo)致切片產(chǎn)生不完整狀況；如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可導(dǎo)致組織產(chǎn)生過(guò)度收縮，進(jìn)而導(dǎo)致切片產(chǎn)生易碎裂狀況；④包埋時(shí)要求動(dòng)作迅速，若操作過(guò)慢，包埋蠟和組織塊之間溫差較大，可能導(dǎo)致組織塊和蠟無(wú)法緊密結(jié)合，引起切片困難狀況。

5 切片、染色

5.1 流程如下 ①取出包埋好組織蠟塊，并將其規(guī)整為四棱柱狀，后經(jīng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切為厚度約4～7μm薄片；②經(jīng)粘附劑將薄片牢附在載玻片上，后將載玻片放置在45℃溫箱內(nèi)實(shí)施干燥，干燥完成后蠟片經(jīng)二甲苯予以脫蠟，在經(jīng)梯度酒精以及蒸餾水水化后，使切片可用水溶性染液進(jìn)行染色；③切片染色多采用HE染色法，經(jīng)染色后，切片內(nèi)嗜堿性物被染為紫藍(lán)色，而嗜酸性物被染為粉紅色；完成染色后，利用中性樹膠實(shí)施封片。

5.2 注意事項(xiàng)具體如下 ①切片時(shí)極有可能產(chǎn)生切片不成帶或者切片上伴有裂紋狀況，產(chǎn)生這種狀況原因之一為切片機(jī)刀片上出現(xiàn)缺口。故為避免產(chǎn)生這種狀況，于切片前可于低倍鏡下對(duì)刀片是否具有欠缺口進(jìn)行觀察；②夏季切片時(shí)，為避免蠟塊過(guò)軟，可事先將蠟塊放置在冰箱內(nèi)，等到切片時(shí)取出；③蘇木精染色液的放置時(shí)間較長(zhǎng)極易產(chǎn)生結(jié)晶，因此在使用前需先過(guò)濾將雜質(zhì)去除，或者重新調(diào)配染色液；④在封片時(shí)，滴入中性樹膠量需適中，蓋玻片應(yīng)先從一側(cè)開始，后慢慢向前蓋下，以免產(chǎn)生氣泡。

6 小結(jié)

以上就優(yōu)質(zhì)石蠟切片技術(shù)步驟流程提出要求與改善，嚴(yán)格依據(jù)操作規(guī)范制定可有效實(shí)現(xiàn)制片過(guò)程全優(yōu)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。優(yōu)秀石蠟切片制作環(huán)環(huán)相扣，任意一環(huán)節(jié)未按照規(guī)范操作，最終對(duì)染片質(zhì)量產(chǎn)生不同程度影響。高質(zhì)量石蠟切片制作是一項(xiàng)要求精細(xì)且程序繁瑣工作，每一項(xiàng)操作均可直接影響切片質(zhì)量，要求以科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)態(tài)度認(rèn)真對(duì)待每一項(xiàng)操作，并準(zhǔn)確把握每一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，形成良好習(xí)慣。此外，還需虛心向他人學(xué)習(xí)，互相交流，并予以總結(jié)與摸索，形成屬于自己一套好方式與經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)將理論和實(shí)際相結(jié)合，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作流程制作，最終可制作為滿意切片。總之，石蠟切片技術(shù)是于組織學(xué)中一項(xiàng)重要試驗(yàn)技術(shù)，仍需不斷持續(xù)改善，以提高制片效果。