尿液代謝組學的應用研究

田智，劉銳，盧夢月，劉付昌盛

(1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530000；2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530000)

0 引言

代謝組學是繼蛋白組、基因組等技術之后開發的一門新興技術，通過對差異代謝物及所涉及的代謝通路分析疾病治療過程中的相關機制[1]。其目的主要是利用核磁共振(NMR)[2]、液相與質譜聯用(LC-MS)[3]、氣相與質譜聯用(GC-MS)[4]等代謝分析平臺，分析差異性代謝產物，根據標志物及代謝通路利用數據庫分析疾病等變化[5]。目前，代謝組學已成為新的研究工具[6]。生物體液是代謝組學研究的主要樣本來源之一，在生物體液中包括血液、痰液、尿液等，因尿液最易收集所以最為常用[7]。傳統的使用血液的實驗室測試仍然是最常見的診斷手段，但這種方法是侵入性的通常患者依從性差。因此，必須開發使用更方便的樣本的準確和具體的測試。尿液收集是無創的，不需要病人準備或消耗，這大大提高了依從性。因此在代謝組學分析中，特別是在臨床實踐[8]中是首選的。代謝組學方法在[9]的許多臨床領域有助于診斷和治療學的發展。液相色譜(LC)與質譜(MS)或核磁共振(NMR)檢測相結合，是尿液代謝組學[10]中一種很有前途的微分離平臺。

1 代謝組學研究方法

完整的代謝組學研究方法在分析前需進行樣本收集，在收集樣本的選擇上生物樣品的來源主要有生物體液、組織及細胞，沉淀蛋白、固相萃取法等是生物體液的主要預處理方法，而組織、細胞可利用超聲破碎技術提取[11]，收集樣本后保存在-80℃冰箱。在分析前將樣本在冰上解凍后，在儀器上進行分析，通過主成分分析和偏最小二乘判別法分析法等建立模型，并對模型進行驗證，最后篩選出差異性代謝物。結合HMDB(Human Metabolome Database)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)等代謝組學的數據庫，并找出差異性標記物所相關的代謝通路，并其進行分析。

2 尿液取樣方法

尿液是代謝組學中最常見的標本[12]。并且較其他樣本更易于收集，在代謝物的定量、定性和數據分析中可以連續重復取樣[13]。尿液作為人體的排泄物，尿液中的代謝物可能與疾病的發生發展、藥物的代謝變化密切相關。正因為如此，有研究者做出了相當大的努力來研究尿代謝組學作為診斷工具[14]。尿液的樣品前處理相較于血液等較簡單，因為它缺乏復雜性和較低的蛋白質含量，從而使它特別適合代謝組學[15]。但目前仍需要大量的發展工作來完善尿代謝組學的標準化，并驗證早期的報告。有必要闡明其他疾病的診斷概況和縱向分析，以評估治療和評估預后。

3 尿液代謝組學的數據庫

代謝組學是一個新興的“組學”研究領域，該代謝體可以被定義為在一個特定的細胞、器官或有機體中發現的所有小分子代謝物的完整補體[16]。它與基因組、轉錄組和蛋白質組非常相似。由于人類基因組項目，大部分的人類基因組，轉錄組和蛋白質組現在已經已知，數據可以通過電子方式獲得。但是，人類的新陳代謝體還不明確。為了糾正這種情況，人類代謝項目(HMP)于2004年啟動，這是識別和量化人體體內所有可檢測的代謝物的一部分。除了實驗識別和量化不同體液中數百種代謝物，這個多年項目的正式任務是為了確認所有以前識別的代謝物的信息，并提供這些信息作為一個稱為人類代謝數據庫(HMDB)的免費電子數據庫。研究人員使用核磁共振(NMR)光譜、質譜(MS)、化學結構或化學公式搜索的數據庫[17]。并需要尋找代謝物的濃度、性質、位置或代謝物-疾病關聯。因此，代謝組學數據庫不僅需要關于化合物和反應的信息，而且需要關于化合物濃度、生物流體或組織位置、物理性質和已知疾病關聯等數據。這些數據需要隨時獲得，實驗驗證，充分引用，容易搜索、解釋，它們需要盡可能多地覆蓋人類的新陳代謝體開發了HMDB數據庫。

4 尿液代謝組學在疾病中的應用

尿液代謝組學已廣泛應用于各種疾病的研究，代謝組學可以幫助識別疾病生物標志物，提高對疾病發病機制和藥物效應的認識[18-19]。代謝組學是一個快速擴展的領域，可以描述細胞的代謝途徑，它提供了一個強大的工具來評估一個人的生理狀態，它產生了比簡單的基因表達[20]更接近表型的細胞活動快照，從而為確定疾病進展的新生物標志物和進一步闡明疾病發展的潛在病理生理機制提供了寶貴的資源，最重要的是，它可能揭示新的治療靶點，以獲得新的洞察藥物作用機制。有研究者采用代謝組學技術研究慢性萎縮性胃炎大鼠尿中的內源性差異代謝物，發現有68種差異代謝物，25種表達上調，43種表達下調[21]。主要代謝途徑為D谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，組氨酸代謝和嘌呤代謝。段曉璐等[22]利用核磁共振技術研究腎結石患者和健康對照組對比差異性代謝產物，發現兩組共15種代謝物的濃度明顯不同，4種代謝途徑，發現乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、苯丙氨酸代謝和檸檬酸循環(TCA循環)與腎結石密切相關。有研究[23]表明腎損傷是使用順鉑的主要副作用之一，代謝組學分析可以允許識別順鉑的腎毒性機制和識別順鉑誘導的損傷的生物標記物，代謝組學分析表明，37和35內源性代謝物水平分別在大鼠尿液和腎臟中發生變化，破壞了7條關鍵代謝途徑，包括三羧酸循環(TCA循環)、苯丙氨酸代謝、牛磺酸和低磺酸代謝和煙酸和煙酰胺代謝等代謝通路。吳桂霞等[24]研究丹紅注射液治療高血壓大鼠的尿液代謝物的特點，發現丹紅注射液在改善機體內環境，調節代謝物的排泄等方面發揮作用。邵曉妮等[25]發現慢性高尿酸血癥性腎病大鼠腎臟和尿液共有26中相同的差異代謝物，其中葡萄糖、天冬氨酸、谷氨酰胺和甲基腺嘌等可能為潛在標記物，肯與腎功能的損傷密切相關。

5 尿液代謝組學對中醫證型的研究

隨著尿液代謝組學的發展，發現可對中醫的證型研究提供有效研究手段，為中醫證型提供客觀依據。楊夢等[26]應用采用代謝組學(UPLC-Q/TOF-MS)技術，對比正常組和心氣陰虛證心衰大鼠尿液代謝產物，發現25種潛在生物標記物，主要與氨基酸代謝、脂代謝等相關。李靜等[27]研究冠心病血瘀證大鼠尿液代謝組學變化，發現冠心病血瘀證模型主要涉及泛酸和輔酶A生物合成、丙酮酸代謝、嘌呤代謝等代謝通路。茍小軍等[28]應用代謝組學技術研究非酒精性肝病肝膽濕熱患者尿液代謝物特征，發現12個差異代謝產物，與肝膽濕熱證患者密切相關的通路主要涉及色氨酸代謝、糖酵解或糖異生等代謝通路。

6 尿液代謝組學在中藥復方中的應用

中藥復方具有多成分、多靶點、多通路等特點，中藥復方機制一直是研究的難點，但代謝組學可以為中藥復方治療后機體代謝變化提研究供方法，在整體上尋找中藥復方代謝后的差異性代謝產物及所涉及的相關通路，從中分析出中藥復方的治療特點和優勢。左健等[29]利用尿液代謝組學技術和網絡藥理學研究證明清絡飲可以改善關節炎大鼠的脂肪酸、氨基酸和能量代謝。劉志剛等[30]通過代謝組學研究六味補氣膠囊治療治療COPD穩定期肺氣虛證患者，分析治療前后血漿和尿液，并對數據進行代謝組學分析，發現血漿中的十六烷酸、組氨酸、賴氨酸、蘇氨酸等含量趨勢發生變化，尿液的代謝物比治療前有改變，各代謝物趨勢向健康組的代謝物趨勢發展。劉婷等[31]研究口服葛根芩連湯后大鼠的尿液、血液和糞便等代謝產物，分析發現代謝途徑包括甲基化、脫甲基化和葡萄糖醛酸共合等，進一步了解葛根芩連湯的吸收和代謝，為臨床藥理研究提供客觀依據。王鑫等[32]建立了一種基于超高效液相色譜結合Q-Exactive四極靜電場軌道質譜(UPLCQ-ExactiveOrbitrap-MS)的尿液代謝組學方法，觀察糖尿病視網膜病大鼠的代謝變化，研究補腎活血方對糖尿病腎病的治療作用，結果發現了9種與糖尿病腎病相關的潛在生物標志物，研究發現這些生物標志物主要與脂質代謝、色氨酸代謝和腸道微生物代謝有關。金一寶等[33]通過代謝組學技術研究辛伐他汀對不同性別小鼠尿液代謝的影響，發現6個主要差異代謝物，與體內脂類代謝有關，雌鼠和雄鼠表現出不同的變化規律。

7 思考與展望

代謝組學技術在世界生命科學及生信領域已得到廣泛應用，尿液代謝組學只運用最終的代謝產物，可免除繁雜的生物反應，但還需不斷完善，如實驗費用昂貴，樣本收集要求高，推廣普及較難。

尿液代謝組學在多種疾病診療中已有較多創新的成果，體現了其在疾病診療及中醫藥研究證型、方藥等方面的突出優勢，有可能是解決中醫藥系統機制的關鍵方法，通過對技術的不斷改良，數據庫的不斷完善，加強國際間的合作，為中醫藥的長遠發展提供現代模式。

8 利益沖突

本文作者聲明不存在與本文相關的利益沖突。