新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒的性能驗證

王亞飛，宋凌燕，馮都都，馬良，王晉霞，陳莎麗，史盟浩，李豪哲，曹慧媛，匡雪莉，紀愛芳

(長治醫學院附屬和平醫院檢驗科，山西 長治 046000)

0 引言

新型冠狀病毒(2019-nCoV)引起的肺炎從2019年底開始廣泛傳播，并在全球蔓延，形勢十分嚴峻。COVID19已經成為世界衛生公共安全所要面對的問題。根據《新型冠狀病毒肺炎診療方案》，新型冠狀病毒肺炎確診病例的診斷標準為有流行病學史和臨床表現的疑似病例同時具備病原學或血清學證據之一者。常用的病原學證據即為實時熒光RT-PCR檢測2019-nCoV核酸陽性[1]。為確保本室新型冠狀病毒核酸檢測結果質量的可靠，根據《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》(CNAS-CL02-A009)和《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》(CNAS-GL039)，對上海伯杰醫療科技有限公司生產的2019-nCoV核酸檢測試劑盒在Lepgen-96全自動醫用PCR儀上的性能驗證，內容包括方法符合率、檢出限、精密度、交叉反應等[2-3]。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

健康體檢者咽拭子2019-nCoV核酸檢測陰性樣本。2019-nCoV RNA液體性能驗證參考品(廣州邦德盛公司)，濃度為2.0×106copies/mL和2.0×105copies/mL的2019-nCoV RNA假病毒核酸標準物質編號分別為GBW(E) 091133和GBW(E) 091132。陰性對照及陽性對照為試劑盒配套。

1.2 試劑和儀器

核酸提取試劑和EX3600全自動核酸提取儀(上海之江生物科技股份有限公司)、新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑(上海伯杰醫療科技有限公司)、Lepgen-96全自動醫用PCR儀(山東鑫貝西科學儀器有限公司)。

1.3 方法

按核酸提取試劑盒說明書進行核酸提取，實時熒光RTPCR測定按核酸檢測試劑說明書操作，用ORF1ab基因和N基因作為檢測靶基因。擴增條件：50℃，15min；95℃，15min；94℃，15s，55℃，45s，40個循環。使用配套軟件(Real-Time PCR軟件v2.4)進行數據分析。根據擴增曲線，調整基線和熒光閾值，得到不同通道循環閾值(cycle threshold，Ct)。陽性標準為FAM和VIC通道有明顯擴增曲線，且Ct≤40；陰性標準為FAM和VIC通道無擴增曲線或Ct值＞40，且Cy5通道有擴增曲線；如僅在FAM或VIC單一通道Ct值≤40，另一條通道無擴增曲線，則結果需復檢，復檢結果一致可判為陽性，復檢均為陰性則判為陰性。

1.4 性能驗證方法

1.4.1 符合率

選用相同檢測方法的通過ISO15189認可和衛生健康委員會組織的2019-nCoV核酸檢測室間質評的實驗室作為參比實驗室。選取陰陽性樣本各6例，其中陰性樣本為健康體檢2019-nCoV核酸為陰性的樣本、陽性樣本3例使用上海伯杰醫療科技有限公司生產的新型冠狀病毒SARS-CoV2企業參考品2(濃度為5×103copies/mL，貨號：ZC-HX-201CKP2)進行原倍、2倍、20倍稀釋，2例使用檢測試劑盒自帶陽性對照品(濃度為1×105copies/mL)進行原倍、100倍稀釋。1例使用廣州邦德盛生物科技有限公司生產的室內質控品S1(濃度為2.19×103批號為2020013)。按照患者樣本檢測程序與參比實驗室進行比對，以參比實驗室結果為準，計算本實驗室與參比實驗室的總符合率、陽性符合率和陰性符合率。

1.4.2 檢出限

根據試劑說明書聲明的檢出限為500copies/mL，使用上海伯杰醫療科技有限公司生產的新型冠狀病毒SARSCoV2企業參考品2(濃度為5×103copies/mL，貨號：ZC-HX-201CKP2)進行10倍稀釋后重復測定5次，100%檢出靶核酸，則檢出限驗證合格。

1.4.3 交叉反應

本實驗使用的分析特異性參考品為廣州中山達安公司生產的標準物質。取一定濃度與待測核酸可能存在交叉反應的病原體加入經確認為陰性的樣本中，與常規標本一樣處理，至少重復檢測3次。判斷標準為結果應為陰性。

1.4.4 精密度

檢測濃度為5.0×103copies/mL和5.0×105copies/mL的參考品，同一份樣本重復測定10次，計算各靶基因Ct值的變異系數，評價批內不精密度。每份樣本重復測定2次，連續測定5天，計算各靶基因Ct值的變異系數，評價批間不精密度。判斷標準為符合說明書聲明范圍批內、批間CV均不大于5.0%則驗證合格。

2 結果

2.1 符合率

本試劑檢測結果與參比實驗室檢測結果進行比對，發現6例陽性標本ORF1ab基因和N基因Ct值均＜40，6例陰性標本均沒有Ct值，總符合率、陽性符合率和陰性符合率均為100%，符合率驗證合格。

2.2 檢出限

在檢測下限驗證中，本試劑盒對濃度為5.0×102copies/mL的2019-nCoV RNA陽性樣本ORF1ab基因和N基因Ct值均＜40，檢出率為100%。結果符合試劑說明書聲明標準，檢出限驗證合格。

2.3 交叉反應

交叉反應驗證中檢測含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、人巨細胞病毒、EB病毒、肺炎支原體、結核分枝桿菌樣本的2019-nCoV陰性樣本，重復3次的N基因及ORF1ab基因Ct值均＜40，結果均為2019-nCoV陰性。

2.4 精密度

重復性驗證中5.0×105copies/mL 濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV值分別為0.53%和0.48%；5.0×103copies/mL 濃度水平的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分別為0.75%和0.61%。批間不精密度驗證中5.0×105copies/mL 濃度的N基因和ORF1ab 基因的Ct值CV分別為1.98%和2.01%；5.0×103copies/mL濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV為1.41%和2.15%。CV符合試劑說明書要求標準(＜5%)，精密度驗證合格。

3 討論

熒光定量聚合酶鏈式反應在核酸檢測中具有很高的靈敏度和特異度、高通量等優點作為新型冠狀病毒肺炎的確診方法[4]，在快速診斷、疫情防控中發揮了及其重要作用。隨著新冠肺炎防治的常態化，SARS-CoV-2核酸檢測也更加常規化。為確保本室新型冠狀病毒核酸檢測結果質量的可靠，根據《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》(CNAS-CL02-A009)和《分子診斷檢驗程序性能驗證指南》(CNAS-GL039)，核酸檢測試劑進入臨床使用前應進行性能驗證。

本研究所驗證的核酸檢測試劑以2019-nCoV的ORF1ab和N基因設計特異性引物和熒光探針通過熒光定量PCR儀進行擴增，實現對新冠病毒核酸的檢測。準確度是指測量結果與真實結果之間的接近程度或一致性。本研究對6份陽性質控及6份陰性質控品檢測結果與真實值完全一致，說明檢驗結果準確可靠。精密度是在規定條件下，對同一被測對象多次重復測量所得結果的一致程度，通常以標準差或變異系數表示。本研究顯示批內精密度高濃度標本的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV值分別為0.53%和0.48%；低濃度標本的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分別為0.75%和0.61%。批間精密度高濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV分別為1.98%和2.01%；低濃度的N基因和ORF1ab基因的Ct值CV為1.41%和2.15%。批內精密度變異系數均在1%以內，批間精密度變異系數均在3%以內，符合廠家批內批間精密度小于5%的聲明，說明試劑性能穩定，重復性好。檢出限是指試劑對待測樣本的檢測能力，即靈敏度。驗證試劑的靈敏度，即是對低濃度樣本(檢出限)的檢出率。本研究顯示樣本濃度在500copies/mL的時候在檢測結果均為陽性，滿足說明書的檢測限，說明該試劑具有足夠的檢測能力。最低檢出限是分子診斷產品的重要指標，設置較低容易造成假陽性，設置過高容易造成假陰性[5]。因此在弱陽性樣本的判斷上，不同核酸檢測試劑盒產品可能會得出不同結論。對于此也有研究表明不同試劑對弱陽性樣本檢出能力是有很大差異[6,7]。因此有研究建議對于沒有灰區設置的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒，當檢出的Ct值與判斷陽性閾值的Ct值的差小于3時，建議進行重復實驗，以排除假陽性或假陰性的可能[8]。交叉反應主要是驗證與檢測對象可能存在交叉反應的核酸物質對檢測的影響，對于冠狀病毒核酸檢測來說，主要與檢測對象核酸序列具有同源性，易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸，由于本室資源有限僅驗證了甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、腸道病毒、肺炎支原體、EB 病毒、人巨細胞病毒和結核分枝桿菌無交叉反應。

雖然試劑盒上市前經過了嚴格的臨床試驗，但是進入新實驗室臨床檢驗前還需進行性能評價，以驗證其產品符合其聲明的范圍，保證檢驗質量的可靠性。本研究結果表明上海伯杰醫療科技有限公司生產的新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑盒在Lepgen-96全自動醫用PCR儀上兩個濃度的參考品兩個靶基因的批內批間精密度均小于5%，陰陽性符合率達100%，驗證了其聲明的最低檢出限為500copies/mL，交叉反應等參數進行基本符合臨床應用要求。