附子理中湯減輕非酒精性脂肪肝大鼠炎癥損傷的機制研究*

馬 威，楊家耀△，安 柳，鄒 琦，章 消，劉 念

［1武漢市中西醫結合醫院（武漢市第一醫院），湖北武漢 430022；2湖北中醫藥大學，湖北武漢430065］

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver dis?ease，NAFLD）是全球肝病最重要的病因之一，在未來幾十年內，NAFLD 可能成為終末期肝病的主要病因，嚴重影響成人及兒童［1］。NAFLD 已成為全球人類主要的健康負擔，其可導致肝硬化、肝細胞癌、糖尿病和心血管疾病等的風險增加［2］。研究顯示，NAFLD 的患病率與人民生活水平呈顯著正相關性，其已經成為21 世紀全球公認的公共健康問題之一［3］。NAFLD 是臨床上常見的病理綜合征，目前針對NAFLD 的治療尚未有明確有效的方案［4］。近些年，有關NAFLD 發病的“多重打擊”學說逐漸興起，其認為NAFLD 是由飲食、遺傳和環境等因素共同作用的結果，其中，炎癥因子失衡是其病情發展過程中致肝細胞損傷的重要病理基礎，典型的炎癥反應則是NAFLD 的主要病理表現之一［5］。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）能激活核因子κB（nucle?ar factor kappa B，NF-κB），使其進入細胞核內，激活靶基因的轉錄發生，引起一系列的細胞因子合成與釋放，觸發機體產生級聯式炎癥反應，最終誘發一系列的免疫及炎癥反應［6］。中醫療法在NAFLD 臨床治療上具有一定的優勢，本課題前期研究發現附子理中湯（Fuzilizhong decoction）在NAFLD 細胞模型和動物模型中均可發揮作用［7-8］。本研究在前期研究的基礎之上，從炎癥損傷方面探究附子理中湯對NAFLD模型大鼠的作用及機制。

材料和方法

1 動物與主要試劑

48 只7～8 周齡雄性SPF 級SD 大鼠，體重（250±25）g，購于遼寧長生生物技術股份有限公司［SCXK（遼）2017-0012］。易善復（Yishanfu）購自賽諾菲北京制藥有限公司；附子理中湯配方為人參9 g，白術9 g，炙甘草6 g，干姜9 g，炮附子9 g，該方劑的中藥飲片購于湖北天濟中藥飲片有限公司。檢測白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、腫瘤壞死因子α（tumor ne?crosis factor-α，TNF-α）和IL-6 含量的ELISA 試劑盒購于武漢貝茵萊生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購自TaKaRa；SYBR Green 染料購自Lumiprobe Cor?poration；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒和化學發光試劑購自南京建成生物技術有限公司；兔抗TLR4抗體和兔抗NF-κB p65 抗體、兔抗p-NF-κB p65 抗體和兔抗GAPDH抗體購自Abcam。

2 實驗方法

2.1 構建大鼠NAFLD 模型 采用脂肪乳灌胃法制備大鼠NAFLD 模型［9-10］。脂肪乳由A 液（25 g 豬油加熱溶解，加入10 g 膽固醇，攪拌后加入1 g 丙賽優，混勻后加入25 mL 吐溫80）和B 液（取20 mL 丙二醇至30 mL 水中，加熱至60℃，加入2 g 脫氧膽酸鈉）混合而成。向脂肪乳中加水至100 mL，灌胃劑量為10 mL·kg?1·d?1，持續4周。

2.2 動物分組及治療 48 只SD 大鼠隨機分為6組：（1）對照（control）組：10 mL·kg?1·d?1生理鹽水灌胃8 周；（2）模型（NAFLD model）組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4 周，10 mL·kg?1·d?1生理鹽水灌胃4 周；（3）附子理中湯高劑量組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4 周，20 mL·kg?1·d?1附子理中湯灌胃4 周；（4）附子理中湯中劑量組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4周，10 mL·kg?1·d?1附子理中湯灌胃4周；（5）附子理中湯低劑量組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4 周，5 mL·kg?1·d?1附子理中湯灌胃4 周；（6）易善復組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4 周，30 mL·kg?1·d?1易善復灌胃4 周。造模4 周后，各造模組中隨機挑選1 只大鼠進行肝組織HE 染色后病理分析，鑒定模型是否成功。治療結束后，采用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取腹主動脈血5 mL，分離血清；大鼠頸椎脫臼處死，取肝臟組織，多聚甲醛固定部分組織用于病理觀察，其余組織置于?80℃中保存。

2.3 HE 染色觀察病理學變化 將大鼠肝臟組織從固定液中取出，烘干脫水，浸蠟包埋。將包埋組織切成厚度為4 μm 左右的切片。烤片后，采用蘇木素、伊紅染液分別染色。流水沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察大鼠肝組織病理學變化。

2.4 ELISA 檢測血清IL-2、IL-6 及TNF-α 含量 取分離后的各組大鼠新鮮血清，分別按ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測各組大鼠血清中IL-2、IL-6 和TNF-α的水平。

2.5 RT-qPCR 檢測肝組織中TLR4 及NF-κB p65 的mRNA 表達 加入Trizol 提取大鼠肝組織總RNA，反轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模板進行RTqPCR。反應程序為：95℃5 s，56℃30 s，72℃25 s，共35 個循環。TLR4 的上游引物序列為5′-ACCT?GTCCCTGAACCCT-3′，下游引物序列為 5′-CTCCCAGAACCAAACGA-3′；NF-κB p65的上游引物序列為5′-GGGGACTACGACCTGAATG-3′，下游引物序 列 為5′-GGGCACGATTGTCAAAGAT-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物序列為5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′。由上海生物工程有限公司合成。

2.6 Western blot 檢測肝組織中TLR4 及p-NF-κB p65蛋白的表達 提取大鼠肝組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取20 μg 蛋白上樣，經SDS-PAGE 分離后，將蛋白轉移到PVDF 膜上。封閉1 h，加入Ⅰ抗稀釋液（TLR4 稀釋比為1∶1 000；NF-κB p65 稀釋比為1∶2 000；p-NF-κB p65 稀釋比為1∶5 000；GAPDH 稀釋比為1∶2 500），室溫孵育1 h。PBS 清洗3 次，加入HRP 標記的Ⅱ抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育0.5 h。PBS 清洗5 次，加入ECL 化學發光試劑，于暗室中顯影曝光，根據灰度值計算蛋白相對表達量。

3 統計學處理

采用統計軟件SPSS 19.0進行分析，實驗數據以均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較選擇單因素方差分析，各組均數間的兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 NAFLD大鼠肝組織病理學的變化

HE 染色結果顯示，對照組大鼠肝小葉結構清晰，細胞形態正常，排列有序；模型組大鼠肝細胞出現腫脹，排列無序，細胞間連接松散，細胞內存在脂滴空泡，細胞核著色深并出現裂解，且有明顯的炎癥細胞浸潤現象；附子理中湯低、中、高劑量組肝細胞形態逐漸恢復，腫脹程度逐漸減輕，脂滴空泡現象逐漸減少，炎癥細胞浸潤逐漸減少，且以附子理中湯高劑量組及易善復組大鼠肝組織損傷改善更佳。見圖1。

Figure 1.The effect of Fuzilizhong decoction on pathological changes of liver tissue in rats with NAFLD.圖1 附子理中湯對NAFLD大鼠肝組織病理學變化的影響

2 NAFLD 大鼠血清炎癥因子IL-2、IL-6 及TNF-α水平的比較

ELISA 結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清IL-2、IL-6 及TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠血清IL-2、IL-6 及TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05）；與附子理中湯低、中劑量組比較，附子理中湯高劑量組大鼠血清IL-2、IL-6 及TNFα 水平顯著降低（P＜0.05），提示附子理中湯對NAFLD 大鼠血清炎癥因子的抑制作用呈劑量依賴性。見表1。

3 附子理中湯抑制NAFLD 大鼠肝組織中TLR4 及NF-κB p65的表達

RT-qPCR 和Western blot 結果顯示，與對照組比較，模型組肝組織中TLR4 和NF-κB p65 的mRNA 水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB p65 的mRNA 顯著降低（P＜0.05）；與附子理中湯低、中劑量組比較，附子理中湯高劑量組大鼠肝組織中TLR4 及NF-κB p65 的mRNA 顯著降低（P＜0.05）。而各組肝組織中TLR4及p-NF-κB p65 的變化趨勢與mRNA 變化一致。見圖2、3。

表1 NAFLD大鼠血清IL-2、IL-6及TNF-α水平的比較Table 1.Comparison of serum levels of IL-2，IL-6 and TNF-α in rats with NAFLD（Mean±SD. n=7）

Figure 2.Comparison of the mRNA levels of TLR4 and NF-κB p65 in the liver tissues of rats with NAFLD.Mean±SD. n=7.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NAFLD model group；&P＜0.05 vs low dose of Fuzilizhong decoction group；$P＜0.05 vs middle dose of Fuzilizhong decoction group.圖2 NALFD大鼠肝組織中TLR4及NF-κB p65 mRNA表達水平的比較

討 論

NAFLD 是一種最普遍的肝臟疾病，全球的發病率約為25.24%［11］。研究證明，NAFLD的臨床負擔不僅局限于肝臟相關疾病，更是一種多系統疾病，可影響肝外器官和多種調節途徑［12］。目前，NAFLD 的發病機制尚未明確，接受度最高的機制為“二次打擊”學說［13］。“二次打擊”學說及其所致的炎癥反應在NAFLD病理過程中具有關鍵性作用［14］。臨床上多使用胰島素增敏劑、抗氧化劑和降脂藥物等進行治療，由于這些藥物長期使用多引發毒副作用，使得中草藥和天然產物成為人們尋找來治療NAFLD 的理想藥物［15-16］。

在中醫藥歷史中，并沒有以“脂肪肝”命名的疾病，脂肪肝被稱為“肝積”，其臨床表現可歸納為“肝痞”、“肝壅”、“脅痛”、“積聚”及“痰方”等范疇，其病位主要在肝臟，涉及脾臟與腎臟［8，17］。有學者認為以溫陽化氣為主，恢復其脾胃功能為肝積的治療方案［18］。中藥湯劑附子理中湯由人參、白術、炙甘草、干姜和炮附子制成，人參，其主要成分人參皂苷——具有抗氧化作用，可發揮保肝護肝功效［19］；白術可有效改善NAFLD 患者血脂水平，具有明顯的治療效果［20］；炙甘草活性成分甘草素具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性，并具有抑制肝纖維化的作用［21］；而干姜可溫運健脾，炮附子可回陽救逆。臨床資料也顯示，采用中藥附子理中湯加痛瀉要方加味治療脂肪肝患者2 個月，可降低其血脂和轉氨酶，改善癥狀［22］。本研究結果也顯示，附子理中湯能改善NAFLD 大鼠肝臟損傷，有效降低血清炎癥因子水平。

Toll 樣受體家族（TLRs）是具有典型特征的一類模式識別受體，在激活先天性免疫應答中起著重要作用［23］。TLR4 不僅能識別多種外源性配體，也能識別與炎癥、應激和機體損傷等相關的內源性配體，其與配體結合后主要通過活化髓樣分化因子88 依賴和非依賴性信號途徑，激活NF-κB 從而引發一系列的炎癥和免疫反應［24］。在本研究中，附子理中湯可以抑制TLR4/NF-κB 信號通路，降低炎癥因子IL-2、TNF-α及IL-6在NAFLD模型大鼠血清中的水平。

Figure 3.The effect of Fuzilizhong decoction on the protein levels of TLR4 and p-NF-κB p65 in the liver tissues of rats with NAFLD.Mean±SD. n=7.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NAFLD model group；&P＜0.05 vs low dose of Fuzilizhong decoc?tion group；$P＜0.05 vs middle dose of Fuzilizhong decoction group.圖3 附子理中湯對NAFLD大鼠肝組織中TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達水平的影響

綜上所述，附子理中湯可減輕NAFLD 大鼠肝臟的炎癥反應，其可能的作用機制與抑制TLR4/NF-κB信號通路有關。