HPV E6/E7 mRNA與HPV E6/E7 DNA在篩查宮頸鱗狀上皮內病變中的應用價值

田 莉，陳 文，駱元斌，黃小玲

（甘肅省中醫院 1病理科，2足踝骨科，甘肅蘭州 730050）

宮頸癌是女性最為常見的生殖系統惡性腫瘤之一，發病率在我國女性惡性腫瘤中居第2 位［1-2］。持續感染高危型人乳頭瘤病毒（high-risk human papil?lomavirus，HR-HPV）是宮頸上皮內瘤變（cervical in?traepithelial neoplasia，CIN）和宮頸癌的主要原因［3］。E6 和E7 基因是HPV 癌基因，其表達產物E6 和E7 蛋白是致癌的關鍵［4-5］。有研究表明，HPV DNA檢測并不能準確反映HPV 感染后的活化狀態，而E6 和E7基因無論在HPV 游離或整合狀態均存在，是促進宮頸上皮細胞惡變的重要分子［6-7］，因此檢測HPV E6/E7 mRNA對宮頸鱗狀上皮內病變的篩查和診斷要優于HPV DNA 檢測。本研究通過回顧性統計HPV E6/E7 mRNA 及HPV E6/E7 DNA 病例的分析比較，初步探討兩者在篩查宮頸鱗狀上皮內病變的應用價值。

材料和方法

1 一般資料

回顧性收集2018 年10 月～2019 年10 月甘肅省中醫院病理科行液基薄層細胞學檢查（ThinPrep cy?tology test，TCT）患者標本共206 例，年齡22～73 歲，平均年齡42.13 歲，中位年齡42 歲，排除既往CIN史、自身免疫疾病史、妊娠史、子宮切除史，取材前3 d內無性生活史。

2 實驗方法

2.1 TCT 使用TCT專用宮頸刷采集宮頸細胞樣本，采集宮頸表面及移行帶的宮頸脫落細胞，在細胞保存液瓶中漂洗后，放入全自動細胞制備儀器，通過混勻、過濾、轉移、貼附、巴氏染色后顯微鏡下觀察診斷。根據2001 年國際癌癥協會推薦的泊賽斯達系統（the Bethesda system，TBS）分類標準新改版（TBS-2014）進行閱片判讀。結果分為：（1）未見上皮內病變細胞或惡性病變（no intraepithelial lesion or malignancy，NILM）；（2）意義不明確的非典型鱗狀上皮細胞（atypi?cal squamous cells of undetermined significance，ASCUS）；（3）低級別鱗狀上皮內病變（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）；（4）不能除外高級別鱗狀上皮內病變的非典型鱗狀上皮細胞（atypical squa?mous cells，cannot exclude high-grade squamous in?traepithelial lesion，ASC-H）；（5）高級別鱗狀上皮內病變（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）。

2.2 HPV DNA 檢測 采用HC2 法檢測HPV DNA，使用化學發光檢測雜交信號放大技術，對14 種高危型HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）和5種低危型HPV（6、11、42、43和81）基因型進行分型檢測。

2.3 HPV E6/E7 mRNA基因檢測 試劑盒和儀器均購自河南科蒂亞生物技術有限公司，采用bDNA法，針對14種高危HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68）檢測，主要步驟包括裂解細胞、雜交捕獲mRNA、信號放大、底物發光反應，經Quanti-VirusTM冷光儀檢測光子數，計算機軟件轉換出HPV E6/E7 mRNA拷貝數，自動判讀結果，拷貝數＞0為陽性。

2.4 陰道鏡檢查及宮頸活檢 細胞學出現ASC-US以上結果的標本，于陰道鏡下活檢，行病理組織學檢查，結果分為正常/炎癥、低級別鱗狀上皮內病變、高級別鱗狀上皮內病變和鱗狀細胞癌。

2.5 免疫組化法檢測p16 表達 對活檢的標本，同時使用小鼠抗人p16單克隆抗體，經羅氏免疫組化自動系統染色，結果參照CINtec p16 結果判讀說明書。根據組織中陽性細胞的表達情況，陽性結果為宮頸鱗狀上皮全層或基底層至副基底層的細胞呈連續彌漫著色（任何強度的連續彌漫著色均視為陽性），定位于細胞核和（或）細胞漿；而宮頸鱗狀上皮不著色或孤立、小灶不連續的細胞著色均判讀為陰性結果。

3 統計學處理

本研究采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義；將組織學結果診斷為LSIL 及更嚴重結果的病例以靈敏度、特異度和陽性預測值對HPV E6/E7 mRNA、HPV E6/E7 DNA和p16檢測方法進行性能比較。

結 果

1 標本分組結果

將篩選的206 例患者行TCT 檢測，結果為NILM 93 例（45.1%），ASC-US 50 例（24.3%），LSIL 40 例（19.4%），ASC-H 7 例（3.4%），HSIL 16 例（7.8%）；HPV E6/E7 mRNA 檢測陽性為78 例（37.9%），HPV E6/E7 DNA 檢測陽性為99 例（48.1%）。將診斷結果為ASC-US 及更嚴重病變的113 例標本行宮頸活檢并做病理組織學檢查及p16 免疫組化染色，結果顯示正常/炎癥20 例（17.7%），LSIL 53 例（46.9%），HSIL 33 例（29.2%），宮頸鱗狀細胞癌7 例（6.2%），p16陽性表達46例（40.7%）。

2 不同細胞病理學分級HPV E6/E7 mRNA 和DNA結果的對比情況

對NILM、ASC-US、LSIL、ASC-H和HSIL這5種細胞病理學分級中HPV E6/E7 mRNA 和DNA檢測結果進行統計，發現HPV E6/E7 mRNA 的陽性率分別為22.6%、22.0%、70.0%、71.4%和81.3%（χ2=48.293），HPV E6/E7 DNA的陽性率為24.7%、54.0%、70.0%、85.7%和93.8%（χ2=46.053），均隨宮頸鱗狀上皮內病變的進展呈遞增趨勢（P＜0.05）；在ASC-US 中，HPV E6/E7 mRNA 與HPV E6/E7 DNA 檢出率的差異有統計學意義（P＜0.05），而在NILM、LSIL、ASC-H 和HSIL 中，兩者檢出率的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見表1。

表1 不同細胞病理學分級HPV E6/E7 mRNA和HPV E6/E7 DNA檢出結果統計Table 1.Statistics of detection results of HPV E6/E7 mRNA and HPV E6/E7 DNA in different cytopathological grades

3 不同組織病理學分級HPV E6/E7 mRNA 及HPV E6/E7 DNA結果的對比情況

將細胞病理學診斷結果為ASC-US 及更高級別病變的113 例標本進行病理組織學活檢并統計分析，結果顯示正常/炎癥、LSIL、HSIL 及鱗狀細胞癌4種分級中HPV E6/E7 mRNA 的陽性率分別為20.0%、43.4%、69.7% 和100.0%（χ2=20.238），HPV E6/E7 DNA 的陽性率為30.0%、69.8%、78.8%和100.0%（χ2=18.164），均隨宮頸鱗狀上皮內病變的進展呈遞增趨勢（P＜0.05）。由于鱗癌的例數較少（7 例），且兩者檢出率相同（陽性均為7/7，100%），故將HSIL 與鱗癌例數合并統計，結果顯示LSIL 中HPV E6/E7 mRNA 與DNA 檢出率的差異有統計學意義（P＜0.05），而正常/炎癥、HSIL 和鱗癌中兩者檢出率的差異無統計學顯著性（P＞0.05），見表2。

表2 不同組織病理學分級HPV E6/E7 mRNA與HPV E6/E7 DNA檢出結果統計Table 2.Statistics of detection results of HPV E6/E7 mRNA and HPV E6/E7 DNA in different histopathological grades

4 p16在不同組織病理學分級下檢出結果比較

對行組織學病檢的113例標本同時做p16免疫組化染色，結果顯示正常/炎癥組未見p16 表達，LSIL、HSIL 及鱗癌組的陽性率分別為18.9%（10/53）、87.9%（29/33）和100.0%（7/7），隨宮頸鱗狀上皮內病變的進展而增高，差異有統計學意義（P=0.000）。

5 HPV E6/E7 mRNA 和DNA 對宮頸鱗狀上皮內病變的診斷評估

以組織病理學結果（LSIL 及更嚴重病變）作為陽性結果，分別通過靈敏度、特異度和陽性預測值評估HPV E6/E7 mRNA 和DNA 對宮頸鱗狀上皮內病變的診斷價值。采用單個檢測及與p16 聯合檢測的方法，在統計與p16 聯合檢測時，將任何一項陽性定義為陽性結果（由于鱗癌樣本過少，與HSIL 組一起統計）。結果顯示，在LSIL 中HPV E6/E7 DNA+p16 靈敏度最高，陽性預測值高于HPV E6/E7 mRNA+p16，但低于單用HPV E6/E7 DNA，HPV E6/E7 mRNA+p16 特異度高于HPV E6/E7 DNA+p16，但低于單用HPV E6/E7 mRNA；在HSIL+鱗癌中HPV E6/E7 DNA+p16 靈敏度最高，HPV E6/E7 mRNA+p16 特異度高于HPV E6/E7 DNA+p16，但低于單用HPV E6/E7 mRNA，而陽性預測值最高，見表3。

討 論

宮頸癌的發生與持續感染HR-HPV 有關［8-9］，HPV 可以感染宮頸基底層細胞，其DNA 游離在細胞核內，通過整合到細胞染色體，導致癌變［10-11］。HPV大多數是一過性感染，可自行消退，只有1/3 病例呈持續狀態，當機體接觸致癌因素或免疫水平降低時，經歷5～10 年會發展為CIN 和宮頸癌。目前，臨床使用TCT 與HPV DNA 檢測方法聯合篩查宮頸癌，由于大部分患者感染HPV后可通過自身免疫功能清除病毒［12］，病變惡化時間較長，因此HPV DNA 檢測方式對宮頸癌發生的預測過早，并不能反映病毒感染后的活化狀態［13］。而病毒整合到宿主細胞后，HPV E6和E7 癌基因過表達，分別通過結合抑癌蛋白p53 和視網膜母細胞瘤蛋白（pRb）等［14-15］，造成細胞周期紊亂，使被病毒感染的細胞異常增殖，促進腫瘤的發生。因此有研究顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測更有助于判斷宮頸病變的進展［16］。本研究發現，在NILM、ASC-US、LSIL、ASC-H 和HSIL 細胞病理學分級中HPV E6/E7 mRNA 和DNA的檢出率均隨宮頸鱗狀上皮內病變的進展呈遞增趨勢（P＜0.05），且HPV E6/E7 mRNA 檢出率均低于HPV E6/E7 DNA 檢出率，在ASC-US 中兩者檢出率差異有統計學意義，說明HPV DNA 檢測確實不能反映HPV 整合活化的狀態，這與Johansson等［17］的研究結果相一致。

表3 不同檢測方法在宮頸鱗狀上皮內病變效能對比Table 3.Comparison of efficiency of different detection methods in cervical squamous intraepithelial lesions（%）

本研究對ASC-US 及更高病變的病例行活檢及組織病理學診斷，結果顯示HPV E6/E7 mRNA 和DNA 的檢出率隨宮頸鱗狀上皮內病變的進展呈遞增趨勢，在LSIL 中HPV E6/E7 mRNA 的檢出率低于HPV E6/E7 DNA，差異有統計學意義，這與細胞學結果一致，也從組織病理學角度說明HPV E6/E7 DNA檢測的是游離狀態下的DNA，陽性患者多數可能為一過性感染，易出現假陽性。

目前臨床治療CIN強調個體化，LSIL僅需隨診，不需手術，而HSIL 則需要臨床治療［18］，因此在診斷CIN 時出現一些需要注意的問題［19］：第4 版WHO（2014）女性生殖系統腫瘤分類中將CIN 診斷分為LSIL 及HSIL，LSIL 包括CIN1、濕疣等，HSIL 包括CIN2、CIN3及鱗狀上皮原位癌。由于CIN2可能包含部分LSIL 及部分HSIL，籠統將CIN2 歸于HSIL，可能會導致HSIL擴大化，臨床過度治療［11，18］，因此需要將這樣的情況再進行區分。有研究表明，通過免疫組化染色檢測p16 的表達，對區別兩者有幫助。p16 是一種細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent ki?nases，CDKs）抑制劑，通過抑制CDK4 活性，阻止細胞從G1期進入S期，從而抑制細胞增殖。當p16基因突變，CDK4活性增強，進而引起細胞分裂加速，細胞惡性增殖［20-21］。在HPV 持續感染所致的高級別病變中，p16 呈連續大塊狀深棕色染色，而在低級別病變中，p16 一般為陰性（陰性或不連續灶狀陽性）［18］。本研究結果顯示，p16 的表達陽性率隨宮頸鱗狀上皮內病變級別的增高而增高，這與Gregg 等［22］和Kl?aes等［23］的研究結果一致。而本研究在檢測HPV E6/E7 mRNA 和DNA 的同時加上p16 免疫組化染色，通過對敏感度、特異度和陽性預測值的統計，評估兩種檢測方法對宮頸鱗狀上皮內病變的診斷價值，結果顯示，HPV E6/E7 DNA+p16 靈敏度最高，HPV E6/E7 mRNA 特異度最高，在LSIL 中HPV E6/E7 DNA 陽性預測值最高，而HSIL+鱗癌中HPV E6/E7 mRNA+p16陽性預測值最高，這也與目前的研究結果一致。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA 與HPV E6/E7 DNA 檢測相比，可以更好地反映HPV 的活化狀態，在篩查鱗狀上皮內病變時，避免給患者帶來生理和經濟上的負擔，而在診斷高級別病變時，為避免在臨床篩查時過度檢查與治療，可進行p16 免疫組化染色，這樣更準確地給予臨床參考依據，以便于臨床進行個體化治療。由于本研究樣本數量較少，尤其是HSIL 病例收集不足，HPV E6/E7 mRNA 和DNA 兩種檢測方法在臨床診斷過程中應該聯合采用還是在某種條件下單一采用，還需要更多臨床數據的驗證、支持以及進一步的研究探討。