經過殼聚糖溶液儲存的微弧氧化純鈦骨植入體細胞相容性實驗研究

何夢喬 許妍 荊鳳娟 閆雪蓮 焦雪 姜馨曄

摘要：目的 將鈦微弧氧化涂層鈦片置于不同濃度的殼聚糖溶液中浸泡，對其進行成骨細胞生物相容性檢測，評價其生物相容性。

關鍵詞：純鈦;MC3T3-E1細胞;殼聚糖;抗菌性;生物相容性

【中圖分類號】R4 ?【文獻標識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）14--01

引言

正畸治療過程中常常會遇到一些疑難病例，比如骨性上頜前突、磨牙高位等，這些復雜的病例往往不能通過普通的托槽矯治解決，這時正畸支抗釘進入應用。本實驗主要通過對現有的正畸支抗釘材料進行表面處理，觀察其是否擁有更加優良的細胞相容性抗菌性能。以純鈦和鈦合金材料制作的醫療器械已經廣泛應用于口腔種植、骨折固定、美容植入等領域，隨著對口腔植入物表面改性技術的深入發展，一些有機材料如殼聚糖，海藻酸鈉等有機質開始成為骨修復材料應用于臨床之中。口腔在人體中是一個特殊的復雜成分聚集體。唾液、食物、菌斑，細菌以及其代謝產物的長期混合使得口腔植入物受到感染的風險急劇增大。鈦金屬本身具有生物惰性，不具備抗菌性，支抗釘周圍組織感染是支抗釘手術后失敗的主要原因。如何在保持鈦支抗釘微弧氧化表面的高生物活性的同時增強其抗菌性，降低感染風險是當今研究的發展方向。

1.材料與方法

實驗材料：純鈦微弧氧化鈦片150枚φ=10mm，厚1mm。對照A 組：純鈦微弧氧化鈦片50枚。實驗B組：純鈦微弧氧化-殼聚糖低濃度（1.5g/L）浸泡處理鈦片50枚。實驗C組：純鈦微弧氧化-殼聚糖高濃度（3g/L）浸泡處理鈦片50枚。所有鈦片都經酒精浸泡過夜后紫外線照射30min，每面重復照射3次。

1.1細胞培養

MC3T3-E1（小鼠顱頂前骨細胞亞克隆）細胞購，將凍存的細胞復蘇：從液氮罐中取出凍存管，迅速置于37℃水浴中升溫，2分鐘后取出不斷搖動使其融化。75%乙醇溶液消毒管外壁，置于超凈臺中。吸出細胞懸液加入5ml培養液，1000r/min離心5min，棄上清。加入培養液吹打混勻，置于培養箱里中培養，待細胞長至70%～80%，傳代培養，備用。

1.2細胞黏附性實驗

待細胞鋪滿70%～80%瓶底，用0.25%的胰酶進行消化，細胞計數。將A、B組試件鋪在24孔板內，每種處理方式3個復孔。接種細胞數為2×104/孔，分別培養30min、60min、90min、120min，棄去上清液，PBS沖洗3次，加入無血清的培養基和CCK-8溶液，繼續孵育4h，吸取上清液轉移到96孔板中，酶標儀檢測450nm吸光度值，求平均值并繪制三線表。

1.3細胞增殖性實驗

用0.25%的胰酶進行消化，將A、B組試件鋪在24孔板內，每種處理方式3個復孔。細胞數為5×103/孔，分別培養2、4、6天，棄去上清液，PBS沖洗3次，加入無血清的培養基和CCK-8試劑，繼續孵育3h，避光條件下吸取上清液轉移到96孔板中，酶標儀檢測吸光度值，求平均值并繪制柱狀圖。

1.4統計學分析

選用SPSS20.0 統計軟件分析，數據用平均值±標準差表示，采用重復測量的方差分析，P <0.05 認為差異有統計學意義。

2.結果

2.1CCK-8黏附性實驗

如表1所示，應用spss20.0進行重復測量的方差分析：不同處理組之間的差異，F=82.170，P=0.000<0.05，不同時間點的差異，F=495.555，P=0.000<0.05，差別有統計學意義。培養30min、60min、90min、120min時B、C組黏附的細胞密度顯著高于A組。且各時間點B、C組生長吸光度值均>A組，說明B、C組黏附情況優于A組。

2.2CCK-8增殖性實驗

如表2所示，采用SPSS20.0統計軟件對總體數據進行分析，具體方法用重復測量的方差分析，不同處理組組間采用LSD的兩兩比較。數據以均數土標準差表示， 檢驗水準a=0.05。三組細胞數量均隨著時間的延長而增加，不同處理組之間的差異，F=133.168，P=0.000<0.05，不同時間點的差異，F=364.946，P=0.000<0.05，差別有統計學意義。C組試件表面細胞吸光度值顯著大于A、B兩組，說明C組試件表面細胞增殖狀況最佳。

采用SPSS20.0統計軟件對總體數據進行分析，具體方法用重復測量的方差分析，不同處理組組間采用LSD的兩兩比較。不同處理組之間的差異F=101.806，P=0.000<0.05，差別有統計學意義。不同時間點的差異，F=607.654，P=0.000<0.05，差別有統計學意義。3組試件表面成骨細胞活性均隨著時間增大，第3、5天，C組成骨細胞ALP活性優于AB兩組，顯示高濃度殼聚糖涂層有利于細胞分化。

3討論

在黏附實驗中B、C兩組在吸光度數值上差別不甚顯著。實驗中B、C兩組試件表面的黏附率均大于單純的微弧氧化表層。細胞的增殖能力能夠反應出細胞的整體生物功能特性，在增殖實驗中，C組的試件表面增殖率顯著高于B、A兩組，堿性磷酸酶實驗中，C組堿性磷酸酶活性顯著高于B、A兩組，說明在細胞增殖過程中高濃度組細胞生命活動的細胞生物化學反應更強。

殼聚糖等多糖基物質可預防疾病的發生，抑制多種細菌的聚集;殼聚糖本身能夠促進細胞的增殖和黏附，還具有良好的抑菌作用，也可在多糖材料特定效能的協助下持久有效發揮黏結、抗菌、再生等效果。此外，多糖也可在體內酶解產生單糖，作為細胞生長的能源物質利于組織修復。殼聚糖作為多糖材料中一種較為重要的物質，因其分子中帶有游離氨基，這些氨基通過結合負電子來抑制細菌：殼聚糖的多聚陽離子易與真菌細胞表面帶負電荷的基團作用，從而改變病原菌細胞膜的流動性和通透性;干擾DNA的復制與轉錄;阻斷病原菌代謝。殼聚糖作為一種多糖類也具備較高的生物相容性與良好的生物降解速率。殼聚糖作為細胞外基質分泌的誘導劑能使軟骨細胞易于黏附在殼聚糖表面，相比與其他多糖化合物而言殼聚糖則是甲殼素脫乙酰之后的物質，它的特殊性在于其分子鏈帶有正電荷從而使得殼聚糖成為自然界中獨一無二的具有活性氨基（-NH2）的聚陽離子弱堿性多糖，因此也這使得該材料易于結合帶負電荷的細菌細胞壁并附著于 DNA，從而抑制細菌的復制。

4結論

本研究結果表明：3組材料均具有良好的生物相容性，其中純鈦微弧氧化-高濃度殼聚糖浸泡處理的涂層對于細胞的黏附、增殖以及堿性磷酸酶表達均有顯著的促進作用，說明殼聚糖浸泡有利于植入的鈦支抗材料的初期穩定性以及早期礦化，是一種理想的植入物儲存材料。

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