MUC1-GEM-PBCA-NP、CA199-GEM-PBCA-NP靜注對裸鼠胰腺癌種植瘤的抑制作用對比觀察

張林，侯艷紅，李春梅，劉浩潤

中國人民解放軍總醫院第八醫學中心，北京 100091

近年胰腺癌發病率及病死率呈快速上升趨勢[1]，加之治療效果差，臨床5年生存率在各種惡性腫瘤中最低，急需治療效果更好且毒性更小的治療方法。隨著分子靶向治療的迅速興起，目前部分分子靶向治療的效果顛覆了人類過去的認知，針對胰腺癌的分子靶向治療研究也成為了新的熱點。我們前期研究顯示[2-3]，表面偶聯抗表皮生長因子受體單克隆抗體以及黏性蛋白1(MUC1)單抗的載吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒對裸鼠胰腺癌種植瘤均有一定的靶向性和抑瘤作用。糖類抗原199(CA199)是目前針對胰腺癌特異性最好的血清腫瘤標志物，國內外已廣泛應用于臨床檢測、預后判斷[4-5]，也有研究將其作為治療的靶向分子進行實驗。CA199本身就是由MUC1分子部分糖蛋白變異形成的，其中一些脫落入血，便可在血清中檢測到而成為腫瘤標志抗原[6]。胰腺癌患者血清CA199升高明顯，且隨病情變化而發生變化，提示CA199可能成為治療的靶標。2019年8—11月，我們將MUC1與CA199單克隆抗體偶聯吉西他濱聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒(MUC1-GEM-PBCA-NP、CA199-GEM-PBCA-NP)注入胰腺癌種植瘤裸鼠體內，比較兩者抑制胰腺癌種植瘤的作用，旨在比較MUC1和CA199單克隆抗體修飾載藥納米粒的再導向治療作用強弱。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c裸鼠65只，雌性，6～8周齡，體質量18～22 g。動物實驗于中國人民解放軍總醫院第八醫學中心動物實驗室進行，實驗條件：實驗室溫度(22～25)℃，相對濕度40%～70%RH，相對空氣壓力10～20 Pa，空氣交換頻率10～15次/小時，備有中央空調和空氣過濾機械設備，動物籠具、飲水、墊料、飲用水等均經高壓蒸汽消毒，每籠3只鼠，飼以SPF級專用顆粒飼料，自由飲水。

1.2 抗體、試劑及儀器 MUC1單克隆抗體(Abnova公司)，CA199單克隆抗體(Abcam公司)，α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA，北京瞬康醫用膠有限公司)；人胰腺癌細胞株PANC-1(北京富眾科技發展有限公司)，細胞培養于含胎牛血清、青霉素、鏈霉素的DMEM培養液中；85-2恒溫加熱磁力攪拌器(上海志威電器有限公司)，Dextran-70、PluronicF-127(德國BASF公司)，吲哚菁綠(Cy3，上海晶純生化科技股份有限公司)，微孔濾膜(欣惠澤奧有限公司)，Zetasizer-Nano ZS90型激光粒徑分析儀(英國馬爾文公司)，IX71熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 CA199-GEM-PBCA-NP、MUC1-GEM-PBCA-NP及相應熒光納米粒子的制備 GEM-PBCA-NP的具體制備方法參考本研究組李春梅等[3]的實驗方法。制備完成后用激光散射粒度分析儀來觀察微球粒徑的大小及分布，并計算包封率及載藥率。熒光納米粒子的制備同樣參考本研究組李春梅等[3]的實驗方法：滅菌水溶解Dxtran-70、PluronicF-127及Cy3作為水相，余制備方式同GEM-PBCA-NP的制備，制備備用含熒光Cy3-PBCA-NP(0.5 mg/mL)，抗MUC1及抗修飾的熒光納米粒方式同MUC1-GEM-PBCA-NP的制備。按前述方法所得到的納米粒電鏡下觀察形態表現為光滑的球形，藥物均勻地分散在聚合物基質中。GEM-PBCA-NP、MUC1-GEM-PBCA-NP和CA199-GEM-PBCA-NP納米粒的平均尺寸分別為(48.80±5.64)、(56.37±5.66)、(57.25±5.81)nm。GEM的包封率和載藥量在GEM-PBCA-NP、MUC1-GEM-PBCA-NP、CA199-GEM-PBCA-NP納米粒分別為47.35%±5.14%、46.22%±4.13%、45.57%±4.96%，8.15%±0.84%、6.96%±0.76%、7.05%±0.69%，表面修飾后納米粒子并無明顯變化。成功制備了MUC1-GEM-PBCA-NP和CA199-GEM-PBCA-NP靶向載藥納米粒子。

1.4 裸鼠胰腺癌種植瘤模型制備 參照李春梅等[3]的方法，取對數生長期的人胰腺癌細胞系PANC-1細胞，PBS洗滌3次，重懸于PBS中并調整濃度為6×107/mL。于每只裸鼠右側腋部皮下注射0.2 mL細胞懸液，觀察成瘤情況。7～10 d成瘤(瘤體直徑>0.5 cm為制備成功的標準)，分組治療前統一建模，建模不成功者直接剔除。制備成功55只裸鼠(實驗分組共需51只，另4只用于抵補到出現觀察期中死亡及其他原因退出實驗的裸鼠)，而后按下述分組情況開始分組治療。

1.5 裸鼠分組及MUC1-GEM-PBCA-NP、CA199-GEM-PBCA-NP靜注方法和腫瘤體積測量、抑瘤率計算 ①腫瘤體積測量：將制模成功的裸鼠隨機分為6組各7只。A組：按吉西他濱2.5 mg/kg等劑量的MUC1-GEM-PBCA-NP經尾靜脈注射；B組：按吉西他濱2.5 mg/kg等劑量的CA199-GEM-PBCA-NP經尾靜脈注射；C組：等量GEM-PBCA-NP經尾靜脈注射；D組：吉西他濱2.5 mg/kg量經尾靜脈注射；E組：等量PBCA-NP經尾靜脈注射；F組：等量生理鹽水經尾靜脈注射為空白對照。每5 d重復治療1次，每3 d測量每只動物腫瘤長徑(a)和短徑(b)，腫瘤體積V=a×b2/2。②移植瘤抑瘤率計算：若實驗過程中有荷瘤鼠死亡，及時估計并記錄死亡時間、解剖以進行尸檢。如果不能及時解剖，則先放入-20 ℃冰箱以減少組織自溶；至藥物治療開始第35 d實驗終末，根據動物福利，應實行安樂死，每組7只動物均處死。剝離瘤體稱重，抑瘤率=[(對照組瘤重-實驗組瘤重)/對照組瘤重]×100%。

1.6 裸鼠分組及MUC1-GEM-PBCA-NP、CA199-GEM-PBCA-NP靜注方法和移植瘤熒光納米粒子分布檢測 另取9只荷瘤裸鼠分為3組各3只。a組：尾靜脈注射MUC1-Cy3-PBCA-NP溶液(10 mg/kg)；b組：尾靜脈注射CA199-Cy3-PBCA-NP溶液(10 mg/kg)；c組：注射等量Cy3-PBCA-NP。于注射后5 h處死裸鼠，取腫瘤組織，用生理鹽水充分沖洗避免殘留血液及組織液影響熒光檢測，濾紙吸干多余水分，迅速放入液氮中冷凍、隨后將冰凍組織切片，將組織切片貼于載玻片后，用P0126封片，置于倒置熒光顯微鏡下檢測激發Cy3所發的熒光，軟件測定熒光強度。

2 結果

2.1 各組腫瘤體積、抑瘤率比較 腫瘤體積、抑瘤率比較見表1。

表1 各組腫瘤體積、抑瘤率比較

2.2 各組Cy3熒光信號強度比較 a、b、c三組的熒光強度分別為34.92±4.41、17.15±2.6、4.82±0.73，a組與其余兩組比較，a、b組比較，P均<0.05。a組主要定為于細胞胞膜及胞質中；b組Cy3熒光信號強度弱于a組，且主要定為于細胞胞膜，胞質中熒光信號較弱；c組Cy3熒光信號微弱，僅部分細胞胞膜的可見。詳見圖1。

注：a為a組，b為b組，c為c組。

3 討論

胰腺癌是目前世界范圍內預后及治療效果最差的惡性腫瘤[7-8]。盡管廣大臨床和醫學科研工作者通過無數次的嘗試改善胰腺癌患者的預后，但結果仍然令人沮喪。為了建立更有效的治療方法，現在全世界范圍內也正在進行著大量的研究[9]。隨著藥物治療研究的進展，對胰腺癌治療采用新穎的傳統細胞毒性化療的組合以及配合最新的靶向藥物成為主要方向。五氟類、鉑類、紫杉醇類等已經成為世界上廣泛使用的細胞毒性藥物用于治療泛癌，在臨床證據確定后這些藥物廣泛用于可切除或不能切除的胰腺癌，但目前輔助化療效果均不佳[10-12]。在靶向藥物方面，除了厄洛替尼，目前還沒有針對胰腺癌的靶向治療策略。隨著近年來研究者對藥物的開發，已經做出了積極的嘗試，并開發出新的治療策略，包括對可切除或邊界可切除的胰腺癌患者進行新輔助化療，多藥聯合治療晚期胰腺癌患者的姑息化療，以及新的靶向藥物、載藥納米或免疫細胞治療等多種治療策略[13-15]。

在諸多的研究中，靶向納米載藥系統近年成為一個主要的方向，已經有多項采用納米載藥系統進行胰腺癌治療的研究[16]。目前選擇適合的靶向分子是影響治療效果的一個關鍵問題，MUC1是胰腺癌靶向治療的一個新的靶點。研究報道[17]，MUC1引導的納米粒子在胰腺癌中具有良好的再導向作用。CA199是胰腺癌最為敏感和特異的血清腫瘤標志物，與MUC1為同源蛋白。GIRGIS等[18]證實，CA199修飾的納米粒對于胰腺癌同樣具有良好的再導向作用。為進一步明確這兩種分子作為靶向治療胰腺癌納米粒子靶標效果的差異，本研究在控制同等實驗條件下進行了CA199與MUC1作為靶向分子對于胰腺癌種植瘤模型動物的抑瘤效果比較。我們制備的MUC1-GEM-PBCA-NP和CA199-GEM-PBCA-NP為粒徑<100 nm的載吉西他濱微粒，前期研究[3]發現這些納米粒已經在動物體內呈良好的組織分布。本研究顯示，MUC1-GEM-PBCA-NP對于裸鼠胰腺癌種植瘤的抑制作用明顯優于CA199-GEM-PBCA-NP，而CA199-GEM-PBCA-NP抑瘤效果也明顯優于無靶向性的GEM-PBCA-NP和吉西他濱原料藥物。這一結果也與我們前期體外細胞殺傷實驗的結果相一致，表明抗MUC1與抗CA199修飾的載藥納米粒對于模型動物體內的胰腺癌細胞均具有一定的殺傷作用，可抑制瘤體生長，均可作為胰腺癌納米藥物的候選靶向分子；抗MUC1修飾的載藥納米粒對于動物體內腫瘤的抑制作用強于抗CA199，在靶向納米粒的設計中可被優先選擇。本研究中采用靶向納米粒的熒光示蹤法評估其再導向作用，抗MUC1修飾的熒光納米粒子可較為高效的結合于種植瘤細胞的細胞膜并進入胞質中，體現了較強的熒光信號，而抗CA199修飾的熒光納米粒子也在種植瘤細胞細胞膜上檢測到一定的熒光信號，胞質中有較弱的信號，但強度顯著低于抗MUC1修飾組，這一結果表明抗CA199再導向納米粒結合到種植瘤細胞上并進入胞內發揮作用的能力較弱。可能的重要原因是由于腫瘤細胞中的CA199大量分泌入血，在血液中可與抗CA199修飾的納米粒子結合起到了類似抗原封閉的作用，導致大量納米粒子表面的抗CA199因結合血清游離抗原而失效，進而大大削弱了其再導向作用。

總之，抗MUC1修飾的納米粒具有更強的再導向作用和腫瘤抑制能力。MUC1可能將是針對胰腺癌開發納米藥物的重要靶向分子。