基于甲型H1N1流感病毒聚合酶鏈反應檢測的實驗室生物安全風險點分析

胡凱，馬宏，王莉，趙二江，賈松樹，郭永軍

(1.河南省醫學科學院，河南 鄭州 450046；2.河南省疾病預防控制中心，河南 鄭州 450000；3.鄭州大學附屬腫瘤醫院，河南 鄭州 450003)

2009年3月墨西哥和美國等先后爆發了甲型H1N1流感，為A型流感病毒，H1N1亞型流感病毒毒株，該毒株包含有豬流感、禽流感和人流感3種流感病毒的基因片段，是一種新型流感病毒，可以人傳染人，隨后在全球蔓延[1-2]。中國首例甲型H1N1流感病例2009年5月發生在四川省，隨即在全國范圍內引起流感大流行[3]。甲型流感病毒表面血凝素是該病毒主要抗原，具有免疫原性，能使人體產生保護性抗體，但易發生變異，從而導致該病毒在人群中暴發流行[4]。為保障實驗室在進行甲型H1N1流感病毒核酸檢測時的生物安全，最大限度地減輕對實驗室人員和環境造成的危害和損失，本文擬明確實驗室采用實時熒光逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術檢測甲型H1N1流感病毒過程中的風險點，并提出降低風險的具體措施。

1 甲型H1N1流感病毒生物學特性

1.1 病原學特點甲型H1N1流感病毒屬于正粘病毒科，甲型流感病毒屬。典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80～120 nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是紅細胞血凝素、神經氨酸酶和基質蛋白M2。病毒顆粒內為核衣殼，呈螺旋狀對稱，直徑為10 nm[2]。在MDCK細胞系中可進行病毒的分離培養。

1.2 病原學穩定性甲型H1N1流感病毒對乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒劑敏感，對熱敏感，56 ℃條件下30 min可滅活[2]。實驗室高壓蒸汽滅菌器可以有效滅活病毒，使用條件可以設定為121 ℃，0.1 MPa，20 min；對大多數化學消毒劑敏感，如乙醚、體積分數為75%的乙醇、含氯消毒劑(二氧化氯500 g·L-1、含氯消毒劑1 000 g·L-1，作用30 min)、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，但氯已定不能有效滅活病毒。

2 風險點的確定

2.1 確定方法根據中國疾病預防控制中心制訂的《突發事件公共衛生風險評估技術方案(試行)》[5]，同時參考澳大利亞和新西蘭制訂的《風險管理標準》AS/NZS 4360—2004[6]，運用文獻法、專家會商法明確實時熒光RT-PCR技術在甲型H1N1流感病毒實驗室檢測過程中的生物安全風險點[7]。

2.2 專家選取選取有傳染病學、醫學檢驗、流行病學、院感和實驗室生物安全管理等專業背景的10名專家，分別來自省、市級疾控機構、省級醫療機構、省級采供血機構、科研機構和高等院校。其中省級疾控機構3名，市級疾控機構1名，省級醫療機構2名，省級采供血機構1名，科研機構2名，高等院校1名。

2.3 信息收集收集甲型H1N1流感病毒相關信息，包括世界衛生組織、國家衛生健康委、中國疾病預防控制中心發布的關于甲型H1N1流感信息、文獻信息和媒體報道信息等。

3 實驗活動程序

依據《甲型H1N1流感診療方案(2010年版)要求[2]，采用實時熒光RT-PCR技術檢測疑似H1N1流感病毒患者的咽拭子、鼻拭子、鼻咽或氣管抽取物、痰中甲型H1N1流感病毒核酸。實驗活動程序主要包括收取標本、標本處理、提取病毒模板、RT-PCR擴增、實驗廢棄物處理及清場。

4 生物安全風險點

4.1 實驗活動風險點包括2項：(1)在收集標本和運送過程中，存在標本管破碎、運送箱被污染的可能；(2)標本震蕩、離心、提取核酸時發生試管破裂、甩出、管帽脫落、彈開、跌落等情況，感染性物質濺出，產生氣溶膠。

4.2 實驗室圍護結構和設備風險點包括3項：(1)標本制備間負壓異常或形成正壓造成人員或氣溶膠外溢，緩沖間互鎖裝置失靈，造成人員被困；(2)生物安全柜故障，如出現斷電、高效過濾器損壞導致的生物安全柜出現正壓、氣流紊亂、氣溶膠泄露；(3)高壓蒸汽滅菌器壓力、溫度出現偏差，造成實驗室廢棄物、患者標本消毒不徹底，壓力過高發生爆炸，未充分冷卻取物造成燙傷。

4.3 實驗人員風險點包括4項：(1)技術操作程序不熟悉，出現加錯試劑或標本、標本在生物安全柜內或外發生溢灑等；(2)生物安全意識不足，缺乏生物安全相關知識，無實驗室良好實驗行為；(3)身體狀況欠佳，有基礎疾病，具有發熱、干咳、乏力等癥狀，可能發生實驗室感染；(4)心理素質不佳，不適應實驗室長時間的密閉環境操作。

4.4 臨時進入實驗室人員風險點包括1項：外來人員(如儀器設備維修維護人員、單位管理人員、輔助人員等)生物安全意識缺乏、未經過系統培訓以及實驗室基本技能欠缺。

4.5 個人防護裝備風險點包括4項：(1)口罩類型不符合醫用標準，密合性檢測不合格，超過有效期，長時間佩戴，受到體液或其他液體噴濺；(2)防護服不符合國家標準，防護服破損、撕裂，防護服受到感染性物質噴濺，穿脫防護服順序錯誤；(3)乳膠手套佩戴錯誤；(4)護目鏡使用錯誤。

4.6 清場及消毒風險點包括2項：(1)消毒劑種類不正確，消毒方式不規范；(2)實驗耗材及實驗固廢、廢液處理不規范。

4.7 意外事件及處理風險點包括2項：(1)利器刺破皮膚；(2)實驗室水、電、燃氣使用中所發生的風險。

5 降低生物安全風險的措施

5.1 規范實驗活動操作嚴格使用有效氯消毒液對樣本容器進行消毒，轉移試管時，動作應輕柔，用試管架或方盒盛裝，移至生物安全柜內進行相應實驗操作。在生物安全柜內使用小型振蕩器，震蕩前擰緊管帽，固定好試管。使用帶密封蓋的生物安全型離心機，發生意外后，不打開離心轉頭蓋，將轉頭整體卸下，移至生物安全柜中打開轉頭蓋。標本開蓋時工作臺面應放置1塊浸有消毒液的布或吸有消毒液的紙。

5.2 加強實驗室圍護結構和設備的維護及狀態確認實驗室應根據甲型H1N1流感病毒實時熒光RT-PCR檢測特點建立圍護結構狀態確認程序和涉及生物安全重要設施設備的維護方案及操作規程，明確緊急狀態下意外事件的處置原則。對于實驗室壓力控制系統要定期進行維護，每次開啟系統均需檢查氣壓，要確保實驗室緩沖間和工作區維持正常梯度壓力。生物安全柜安裝位置應符合相關標準要求，定期由有資質的第三方進行維護性檢驗[8]，每次開機用絲線法初步檢查安全柜壓力正常后，方可開展實驗活動。每次離心時應檢查離心機密封狀態，應建立離心意外事件處置程序。加強高壓蒸汽滅菌器狀態核查[9]，制定高壓蒸汽滅菌器標準操作程序，進行滅菌效果監測，并規范使用記錄。

5.3 進一步促進實驗人員生物安全意識和相關能力提升提升實驗室操作人員的生物安全意識和操作技能是實驗室生物安全管理的一項重要內容，應加強甲型H1N1流感病毒實時熒光RT-PCR檢測實驗室操作的基本技能、檢測規程和流程、儀器設備使用等方面的培訓[10]，并對培訓效果進行考核和驗證。掌握發生溢灑等突發生物安全事件的應急處理方法。實驗操作人員應身體健康，無基礎性疾病，心理素質穩定，能耐受在密閉環境下長時間工作。此外，實驗人員需建立身體健康檔案，預留本底血清，建立實驗人員身體異常發現和報告制度。

5.4 嚴格管控臨時進入實驗室人員實驗室應制定全面的管理程序，嚴格執行實驗室人員準入制度。臨時人員進入實驗室必須有實驗室負責人批準，進入人員需經過生物安全培訓，并告知進入實驗室可能出現的危害，簽署知情同意書。同時需有2名工作人員陪同進入并及時提醒注意事項。臨時進入人員進入時需與實驗室工作人員按照同等防護水平穿戴防護裝備。進入前要測量體溫。臨時人員工作完成后，實驗室應詳細記錄其進入時間及其聯系方式，并告知其在1個最長潛伏期內(14 d)密切關注自己是否出現相應的臨床癥狀，如出現相應癥狀應立即報告相關部門，及時就醫。

5.5 積極落實個人防護要求實驗室應根據不同生物安全危害要求建立不同等級的個人防護裝備使用和監督檢查規范，由單位統一采購具有國家醫療器械注冊證符合相關標準的個人防護用品。實驗室內務人員應每周檢查實驗室內備存的個人防護用品的有效期，檢查存貨效期并對檢查結果負責。一次性醫用外科口罩只用于聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)實驗室試劑準備間和結果分析間，人員進入標本制備間應按照二級個人防護要求佩戴醫用口罩。實驗室工作人員佩戴口罩一般不超過4 h，如遇液體噴濺，需及時用安全的方式進行更換。實驗室應備有一次性吸水材料和有效消毒劑，以備應急處理[11]。必要時應規范佩戴護目鏡。

5.6 規范實驗室清場及消毒實驗室配備充足的空氣消毒機或紫外線燈，實驗前后常規消毒(空氣消毒機每次使用1 h，紫外線燈每次使用30 min)；實驗前后使用500 mg·L-1有效氯的消毒液(84消毒液稀釋100倍)進行桌面、臺面及地面消毒；所用門把手等公共設施每天使用500 mg·L-1有效氯的消毒液消毒3次；實驗前后用體積分數為75%的酒精對生物安全柜進行擦拭；轉運及存放標本的容器使用前后用體積分數為75%酒精進行擦拭或噴灑消毒。所有標本需放置在專用密閉容器中轉運，進行高壓蒸汽滅菌處理后方可離開實驗室。實驗過程中如使用銳器(包括針頭、小刀、金屬和玻片等)要直接棄置于銳器盒內，高壓蒸汽滅菌前對于固態廢物可適當松開包裝袋口以加強滅菌效果[12]。高壓滅菌后固體廢物用專用密閉容器進行包裝、密封、貼標簽，送到醫療廢物暫存地，由有資質的醫療廢物處置機構統一處理，液體廢物高壓滅菌調節液體pH值為中性后方可排出[10,13]。

5.7 制定預案，妥善處置生物安全風險在操作甲型H1N1流感病毒毒株或其他潛在感染性材料時要嚴格執行實驗操作規程，加強個人防護，選擇心理素質好、健康狀態佳的人員進行實驗操作，避免發生針刺事件。在實驗室發生水、電、燃氣故障，可能導致生物安全重大風險時，要制定緊急處置預案。對已發生的污染事件要立即采取消毒措施，污染生物安全柜的操作臺造成局限感染時使用有效氯消毒液對工作臺面進行消毒。含病毒的培養皿碎裂或傾覆造成實驗室污染時，應保持實驗室空間密閉，使用浸有有效氯消毒液的毛巾覆蓋污染區進行消毒處理，大量溢灑時可用有效消毒劑采用熏蒸或氣溶膠噴霧法對實驗室進行整體消毒。