混合乳酸菌及其發酵乳對小鼠腸道菌群失衡的調節作用

陳大衛，任晨瑜，申菲菲，郭蕾，陳春萌，黃玉軍，張臣臣，關成冉，馬文龍，李啟明，楊鎖華，顧瑞霞

（1.揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室食品科學與工程學院，江蘇揚州225127；2.揚州市中醫院，江蘇 揚州225000；3.新希望乳業股份有限公司，成都610023；4.生合生物科技（揚州）有限公司，江蘇 揚州225100）

0 引言

腸道菌群在維持機體的健康過程中發揮著重要的作用，與人體的消化營養、免疫代謝、生物拮抗等密切相關。菌群中有益微生物與有害微生物的種類及數量長期處于動態平衡使得腸道微生態的良好環境得以維持[1-2]。而近年來，抗生素的過度使用使得腸道中有益微生物與有害微生物的種類、數量和比例發生異常變化[3-4]，導致腸道微生態平衡遭到破壞，宿主的正常代謝受到擾亂，胃腸道的發酵、消化食物的能力及定植抗力顯著下降[5]，降低了機體的免疫能力[6]，并誘發II型糖尿病、炎癥性腸病等許多胃腸道疾病[7-9]，對機體的健康產生了較大的影響。

乳酸菌作為腸道中的有益微生物，不僅可以通過代謝產生短鏈脂肪酸、氨基酸、糖類等活性物質來調節腸道菌群[10-14]，還可以通過爭奪腸道內的營養素和占據有效的黏附位點來抑制腸道病原菌的生長，進而改善腸道微生物菌群屏障，達到平衡腸道腸道微生態的作用[15-16]。有研究發現，混合乳酸菌可提前激活機體對Reg IIIγ的免疫應答，并通過顯著提高小鼠腸道內IL-23、IL-22及My D88的表達量來提高機體的免疫能力[17]；同時相較于單菌株而言，混合乳酸菌的發酵產物也更加豐富，發酵產品在風味、功能特性等方面具有更多的優勢[18-19]。因此，在許多發酵食品加工過程中，混合乳酸菌發酵受到廣泛關注與應用。然而，目前對于混合乳酸菌的功能性研究較少，其作用機制也不清楚明確。因此，本文從廣西巴馬長壽人群糞便和云南新疆傳統發酵乳制品中分離篩選出具有良好益生特性的乳酸菌，制備了混合菌懸液及其發酵乳，并對抗生素引起的腸道菌群失衡小鼠進行干預，利用高通量測序技術來研究小鼠腸道菌群的變化，從而探索混合乳酸菌對抗生素誘導的小鼠腸道菌群失衡的調節機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

發酵乳桿菌Xn（Lactobacillus fermentumXn）、植物乳桿菌Yd（Lactobacillus plantarumLa、Yd）、鼠李糖乳桿菌J（Lactobacillus rhamnosusJ），分離自廣西巴馬長壽人群糞便樣品和云南新疆傳統發酵乳制品由揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室提供。

1.1.2 動物及飼料

SPF級BALB/c雄性小鼠6周齡，體重20±2 g，由揚州大學比較醫學中心提供，合格證：SCXK（蘇）2007-0001。

普通飼料（面粉20%、米粉10%、玉米20%、鼓皮26%、豆料20%、魚粉2%、骨粉2%），由江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供。

1.1.3 主要試劑

鹽酸林可霉素注射液，四川天翔藥業；糞便基因組DNA提取試劑盒，德國Qiagen公司；DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；小鼠內毒素（Endotoxin，ET）酶聯免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所；血清球蛋白測定試劑盒、免疫球蛋白G（Immunoglobin G，IgG）測定試劑盒，四川邁克生物科技有限公司；雙歧桿菌計數培養基（BBL）、腸球菌計數培養基（EC）及腸桿菌計數培養基（EMB），青島海博生物科技公司；TruSeq文庫構建試劑盒、MiSeq測序試劑盒，美國Illumina公司。

1.1.4 儀器與設備

全自動滅菌鍋JF-SX-500，日本TOMY公司；超凈工作臺SW-CJ-1F，蘇州凈化設備有限公司；Bugbox厭氧工作站，英國Ruskinn公司；7020型全自動生化分析儀，日本日立儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機，德國Eppendorf股份公司；Multiskan Sky 1510全波長酶標儀，美國ThermoFisher科技有限公司；Millipore Direct-8超純水儀，法國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合乳酸菌菌懸液及其發酵乳制備

菌懸液制備:將L.fermentumXn、L.plantarumLa、L.plantarumYd、L.rhamnosusJ于MRS液體培養基中活化2代后，6 000g離心10 min收集菌體，并用滅菌生理鹽水清洗菌體2次，按活菌數等比例混合懸浮于10%的滅菌脫脂乳中，使其活菌數為108CFU/mL，置于4℃貯藏備用。

發酵乳的制備：將活化好的4株乳酸菌按活菌數等比例混合后以3%的接種量接種至含6%蔗糖的、10%的滅菌脫脂乳中，42℃發酵至活菌數為108CFU/mL，置于4℃貯藏備用。

1.2.2 動物分組及模型建立

42只SPF級Balb/c雄性小鼠飼養在通風、透光和清潔衛生，室溫為23.0±1.0℃，濕度為50%±5%的動物房中，普通飼料適應性飼養1周后，分為12只空白對照組和30只模型組。用鹽酸林可霉素（300 mg/mL）連續灌胃3天造模，每天2次（0.2 mL/次）。造模成功后將模型組分為4組，兩組分別為混合乳酸菌菌懸液干預組和混合乳酸菌發酵乳干預組，每組6只；另外兩組為模型組和自然恢復組，分別為12只和6只，具體飼喂方式見表1。混合乳酸菌菌懸液干預組、混合乳酸菌發酵乳干預組按2.0 mL/100 g（108CFU/mL）分別灌胃菌懸液及發酵乳，對照組、模型組及自然恢復組灌胃等體積的0.9%生理鹽水，記錄每天的進食量及每周的體重，以便調整灌胃量，并觀察動物的毛發變化、尾部肛口干凈程度等。

腸道菌群失衡的判斷標準：小鼠盲腸內容物中雙歧桿菌及乳酸桿菌減少甚至消失，腸桿菌及腸球菌的數量不下降或下降比例小于雙歧桿菌及乳酸桿菌，腸道B/E值[20]（雙歧桿菌及腸桿菌菌落對數值之比）顯著下降，停藥7天后腸道菌群不能恢復正常為造模成功[21]。

表1 試驗動物分組及灌胃劑量

1.3 糞便腸道菌群的檢測

1.3.1 腸道微生物培養計數

分別取造模后模型組、停藥7 d后自然恢復組空白及對照組小鼠盲腸內容物0.1 g至0.9 mL的無菌生理鹽水中，在振蕩器上使之勻漿，梯度稀釋后分別接種于BBL培養基、EC培養基、EMB培養基及MRS培養基中于37℃培養，利用平板計數法進行活菌計數，其中BBL培養基及MRS培養基置于厭氧工作站中培養。

1.3.2 糞便菌群的Illumina高通量測序

灌胃結束后，利用糞便基因組DNA提取試劑盒提取各組小鼠糞便的基因組DNA，送至上海派森諾生物科技有限公司，利用Illumina測序系統對樣品基因組DNA的16S rRNA V3-V4區進行高通量測序。

通用引物序列為F：5'-ACTCCT AC GGGAGGCAGCAG-3'，R：5'-TTACCGCGGCTGCTGGCA C-3'。PCR反應條件：94℃熱變性4 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，21個循環；72℃反應5 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收目標條帶并進行純化，BioTek酶標儀對純化的產物進行定量；構建DNA文庫，均一化后進行上機測序，具體方法參考文獻的方法進行[22-23]。

1.4 小鼠免疫指標的測定

1.4.1 小鼠血清免疫指標的測定

灌胃結束后，小鼠禁食一夜，分別從腹腔主動脈和下腔靜脈取血，移至非肝素化收集管中，0℃靜置30 min，3 000g、4℃離心15 min分離血清。利用日立7020全自動生化分析儀及試劑盒測定大鼠血清中內毒素、球蛋白及IgG的含量。

1.4.2 小鼠脾指數的測定

灌胃結束后，小鼠稱量體重，頸椎脫臼處死之后摘取脾臟，將周圍組織剝離干凈后稱重。脾指數的計算公式如下：

1.5 數據統計與處理

利用Qiime軟件、SPSS 20.0軟件及Origin16.0等軟件對試驗的數據進行統計和分析，數據采用均值±標準差表示，以單因素方差分析進行顯著性檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠腸道菌群失衡模型

小鼠灌胃鹽酸林可霉素3天后，背毛豎起、毛發無光澤、行動緩慢、并伴隨有少量腹瀉的癥狀，其腸道雙歧桿菌、乳桿菌等微生物的含量見圖1。

圖1 小鼠腸道菌群數量及B/E值

由圖1可知，鹽酸林可霉素造模后，模型組小鼠腸道中的雙歧桿菌、乳桿菌及腸桿菌數量顯著低于空白對照組（P＜0.05），且B/E值也明顯下降（P＜0.05），而腸球菌數量顯著增加（P＜0.05）；腸桿菌的下降比例為6.17%，均低于雙歧桿菌的12.63%及乳桿菌的25.06%；同時，在停藥7 d后自然恢復組小鼠腸道中的腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌及乳桿菌數量未恢復或未接近空白對照組，表明小鼠的腸道菌群已失衡。

2.2 小鼠腸道菌群物種豐度及多樣性

稀釋曲線表明，每個樣品的取樣深度，也可以用來比較不同樣本中的物種多樣性情況，小鼠糞便樣品測序的稀釋曲線見圖2。Alpha多樣性是指一個特定區域或生態系統內物種的多樣性。常用物種豐富度（Chao 1/ACE）、Shannon及Simpson表示，小鼠腸道菌群的Alpha多樣性見表2。

可見，隨著測得序列數量的增加，樣本的OTUs逐漸增大，但曲線趨于平緩，上升的趨勢變小，說明Illumina Miseq測序系統能夠獲得了糞便樣品中的絕大部分細菌序列，準確地反映了腸道微生物的豐富度和多樣性。由圖2還可以發現，當測序數據量相同時，模型組小鼠的腸道菌群OTU數量低于空白對照組、混合乳酸菌菌懸液組及混合乳酸菌發酵乳組，表明鹽酸林可霉素的使用造成了小鼠腸道菌群的紊亂。

圖2 小鼠糞便樣品的稀疏曲線

由表2可知，鹽酸林可霉素降低了小鼠腸道菌群的alpha多樣性，其豐度指數與Shannon指數顯著低于空白對照組（P＜0.05），混合乳酸菌菌懸液及其發酵乳的干預顯著提高了小鼠的ACE及Chao1豐富度及Shannon指數（P＜0.05），其豐富度指數也顯著高于空白對照組（P＜0.05），表明混合乳酸菌菌懸液及其發酵乳能夠恢復由鹽酸林可霉素引起的腸道菌群紊亂。

表2 小鼠腸道菌群的Alpha多樣性

2.3 小鼠腸道菌群變化

抗生素的過度使用會對機體的腸道菌群產生較大的影響，而乳酸菌的干預具有良好的改善作用。混合乳酸菌及其發酵乳對腸道微生物的調節作用見圖3。

如圖3A所示，小鼠腸道菌群在門水平上主要為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌門（Cyanobacteria）及放線菌門（Antinobacteria）。鹽酸林可霉素降低了腸道中厚壁菌門的豐度，同時增加了變形菌門和擬桿菌門的豐度，分別為36.58%和53.44%；混合乳酸菌菌懸液及其發酵乳的干預增加了腸道厚壁菌門的豐度，同時降低了擬桿菌門和變形菌門的豐度，腸道菌群結構與空白對照組較為相似。

由圖3B可知，空白對照組、干預組、模型組小鼠腸道在屬水平上的微生物主要為Bacteroidesspp.，Lachnospiraspp.，Ruminococcusspp.，未分類_S24-7屬，Pseudomonasspp.，Helicobacterspp.及Doreaspp.。鹽酸林可霉素降低了小鼠腸道菌群的多樣性，其在屬水平上的主要微生物種類少于其他組，主要為Parabacteroidesspp.，Clostridiumspp.，Escherichiaspp.及Blautia spp.；鹽酸林可霉素還增加了腸道中Escherichiaspp.和Clostridiumspp.的豐度，降低了Blautiaspp.的豐度；混合乳酸菌菌懸液及發酵乳較好的恢復了小鼠腸道中的微生物種類，同時還降低了小鼠腸道中Escherichiaspp.，Clostridiumspp.及Pseudomonasspp.等微生物的豐度，增加了Bacteroidesspp.，Lachnospiraspp.，Ruminococcusspp.和Blautiaspp.的豐度。空白對照組小鼠腸道中Lactobacillusspp.的豐度為0.93%，而在模型組中則未檢測到Lactobacillusspp.，混合乳酸菌菌懸液及其發酵乳干預后，小鼠腸道中的Lactobacillusspp.的豐度分別為0.26%、0.57%，說明混合乳酸菌菌液及其發酵乳均有助于小鼠腸道中Lactobacillusspp.的生長。

圖3 小鼠腸道微生物相對豐度變化

2.4 小鼠內毒素、球蛋白和IgG的含量

抗生素誘導腸道菌群失衡后，會導致機體免疫力的下降。混合乳酸菌及其發酵乳的干預對小鼠免疫能力的影響見圖4。

從圖4中可以看出，模型組小鼠血清內毒素含量顯著高于空白對照組（P＜0.05），脾指數、血清球蛋白及IgG含量均顯著低于對照組及干預組（P＜0.05），表明鹽酸林可霉素降低了小鼠的免疫能力。混合乳酸菌菌懸液及其發酵乳干預后，小鼠血清中內毒素的含量顯著降低（P＜0.05），而脾指數、血清中球蛋白及IgG的含量顯著提升（P＜0.05）。混合乳酸菌發酵乳組小鼠血清中的球蛋白與IgG含量均高于混合乳酸菌菌懸液組，但不顯著（P＞0.05）。

3 討論

抗生素的治療或過度使用會增加腸道中有害微生物煩人數量，并降低有益微生物在腸道上的定殖能力，導致免疫活性物質和免疫細胞的減少，造成了機體的免疫低下[23]。本研究中鹽酸林可霉素的使用，增加了小鼠腸道中Escherichiaspp.，Salmonellaspp.，Parabacteroidesspp.及Klebsiellaspp.的豐度，而這些微生物在代謝過程中產生的腸毒素等有害物不僅增加了小鼠血清中的內毒素含量，也破壞了腸道的菌群平衡[24-25]，使得腸道菌群的豐度和多樣性顯著下降（P＜0.05）；同時Salmonellaspp.會黏附并侵入腸上皮細胞，感染巨噬細胞，降低小鼠的免疫力[26]。

圖4 小鼠免疫指標

表3 腸道菌群與免疫相關指標的相關性分析

試驗的混合乳酸菌的干預增加了小鼠腸道中Lactobacillusspp.，Blautiaspp.和Bacteroidesspp.的豐度，Lactobacillus spp.作為機體先天性免疫系統中的重要成員，不僅可以通過其自身的磷壁酸或分泌的H2O2等活性物質來誘導免疫細胞的增殖及IgA、IgG和TNF-α免疫活性物質的分泌[27-28]，還可以通過改善腸道微生物代謝產生的氨基酸等與免疫相關的活性物質來提高機體的免疫能力[11,29-30]；而Bacteroidesspp.作為機體腸道中的重要微生物，除了吸收和降解膳食中人體不能夠降解的多糖外，還參與膽酸和類固醇的代謝，調節細菌毒素的產生，并增強機體固有的免疫反應等[31-32]。

通過對小鼠糞便菌群及免疫指標進行相關性分析發現（表3），小鼠糞便菌群中的Ruminococcusspp.的豐度與小鼠脾指數呈顯著正相關（P＜0.05），Lachno-spiraspp.及Blautiaspp.的豐度與血清中IgG含量呈顯著正相關（P＜0.05），Escherichiaspp.與血清中球蛋白及IgG含量呈顯著負相關（P＜0.05）。Ruminococcusspp.，Lachnospiraspp.及Blautiaspp.均可以產生短鏈脂肪酸（SCFAs）[27,33]，而SCFAs則可以通過提高腸道上皮屏障功能及促進機體分泌的免疫活性物質和減少促炎細菌來改善機體的免疫能力[34-36]；有研究也發現，腸道中的Ruminococcusspp與其體內的血脂水平成顯著正相關[37]，表明本研究中的混合乳酸菌干可能也具有一定的輔助降血脂功能。Blautiaspp.豐度的增加還有利于改善2型糖尿病及高血脂癥狀[38]；Escherichiaspp.屬于機會性致病菌，能通過定植在腸道黏膜上的特定位點與腸黏膜細胞相互作用發揮致病性，并通過代謝產生的毒素侵入免疫細胞來降低機體的免疫力[39]，而在本研究中，Escherichiaspp.還降低了小鼠血清中的球蛋白和IgG的含量。

4 結論

鹽酸林可霉素造成了小鼠腸道的菌群失衡，引起了小鼠免疫能力的下降。而混合乳酸菌菌懸液及其發酵乳較好的恢復了小鼠腸道中的微生物種類及豐度，抑制了有害菌的繁殖，促進了有益菌的生長，并通過改善腸道中與免疫相關的微生物來調節機體的免疫力。