基于MiSeq高通量測序技術奶疙瘩細菌群落結構研究

倪慧，葛東穎，楊甜甜，單春會，佘雅倩，肖石高，郭壯

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽441053；2.石河子大學 食品學院，新疆 石河子832003；3.湖北澳利龍食品股份有限公司，湖北 宜昌443000）

0 引言

作為我國傳統酸凝奶酪的一種，奶疙瘩是哈薩克族和蒙古族等少數民族傳統特色奶制品，具有咸酸的口感并保留了大量牛奶中的天然營養成分[1]。奶疙瘩可分為干濕兩類，將酸奶用紗布擠掉乳清即為濕奶疙瘩，而將濕奶疙瘩風干后即為干奶疙瘩。作為自然發酵奶制品，奶疙瘩中微生物類群的豐度和多樣性均較高，且以乳酸菌為主[2]。Illumina MiSeq高通量測序技術具有測序深度廣、測試樣本量大和準確性高的優點[3]，廣泛用于酸奶[4]、奶酪[5]和原料乳[6]等乳制品微生物多樣性的解析中。

作為萬頃荒漠中的綠洲，新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州具有塞外江南的美譽，盛產奶疙瘩和酸馬奶等多種發酵乳制品，獨特的環境可能賦予了其發酵乳制品獨特的微生物群系。本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術，對采自伊犁地區的干奶疙瘩樣品，進行基于細菌16S rRNA基因V3-V4可變區的測序，并對細菌類群的基因功能進行了注釋，以期為后續新疆地區奶疙瘩的工業化生產和傳統發酵乳制品的微生物解析提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

干奶疙瘩，新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州。

DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒，德國QIAGEN公司；引物338F/806R，武漢天一輝遠生物科技有限公司；DNA聚合酶、dNTPs mix和PCR緩沖液，寶生物工程大連有限公司；Illumina MiSeq測序配套試劑，美國Illumina公司。

1.1.2 設備

MiSeq PE250高通量測序平臺，美國Illumina公司；R920機架式服務器，美國DELL公司；5810R臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Veriti FAST梯度PCR儀，美 國ABI公 司；UVPCDS8000UVPGDS8000凝膠成像分析系統，英國UVP公司；164-5050基礎電泳儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 樣品采集

于2019年8月的10-13日，8個干奶疙瘩樣品采自新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州（E 80°9'42''～91°01'45''，N 40°14'16''～49°10'45''）牧區，編號為YL1-YL8。樣品采集時候使用手術剪將其按照約10 mm×5 mm×5 mm（長×寬×高）的大小剪碎，放于滅菌的50 mL離心管中備用。

1.3 DNA提取、PCR擴增和高通量測序

使用QIAGEN DNeasymericon Food Kit試劑盒進行微生物DNA提取，并參照王玉榮[7]的方法進行16S rRNA V3-V4區的PCR擴增，擴增產物寄往上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.4 生物信息學分析

使用QIIME分析平臺[8]，將質檢合格的序列依次使用PyNAST對齊[9]、UCLUST劃分得到各分類操作單 元（operational taxonomic units，OTU）[10]、ChimeraSlayer檢查去除含有嵌合體的OTU[11]、序列比對明確分類學地位[12]、在構建系統發育樹的基礎上進行β和α多樣性計算、最后參照蛋白質直系同源簇數據庫（clusters of orthologous groups of proteins，COGs）使用PICRUSt軟件注釋細菌的基因功能[13]。

本研究將在8個奶疙瘩樣品中均存在且平均相對含量大于1.0%的細菌門和屬定義為優勢細菌門和屬；將在所有樣品中均存在的OTU定義為核心OTU；若某個OTU在聚類I的樣品中均存在，而在另一聚類樣品中均不存在，則將其定義為聚類I的特有OTU，反之亦然[14]。

1.5 圖形繪制與數據分析

基于UniFrac距離使用非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類進行β多樣性分析，使用Moon-Median檢驗進行不同聚類間各指標的差異性分析。使用R軟件（v3.6.2）的waterfall和pheatmap軟件包繪制氣泡圖和基因功能熱圖，使用Origin2017繪制其他圖。

2 結果與分析

2.1 細菌群落結構β和α多樣性研究

納入本研究的8個奶疙瘩樣品共產生230 905條高質量的16S rRNA序列，平均每個樣品28 863條，UCULST劃分得到43 299條代表性序列和4 495個OTU，最后剔除67個嵌合體后尚存4 228個OTU。基于UniFrac非加權與加權的UPGMA聚類分析，結果如圖1所示。

圖1 基于UniFrac非加權（a）與加權（b）的UPGMA聚類分析

由圖1可知，在基于UniFrac非加權聚類分析中樣品形成了明顯的聚類趨勢，其中樣品YL1、YL4、YL5和YL6形成聚類I，樣品YL2、YL3、YL7和YL8形成聚類II，而這種聚類趨勢在加權聚類分析中并不明顯。導致這種現象發生的原因在于，不同奶疙瘩樣品中優勢菌屬可能無明顯不同，但在OTU水平上或在若干相對含量較低的細菌類群上存在一定差異。本研究對測序深度與發現物種數和香農指數的變化趨勢進行了分析，結果如圖2所示。

圖2 發現物種數（a）和香農指數（b）曲線

由圖2可知，即使測序量最多的樣品YL8（31 489條），其發現物種數曲線仍呈上升趨勢，而測序量最少（25 571條）的樣品YL3，其香農曲線在測序深度約為3 000條時即進入了平臺期。由此可見，本研究的測序深度已可完全捕獲奶疙瘩樣品中細菌的多樣性，測序數據可滿足后續分析的要求。由圖2亦可知，經Moon-Median檢驗發現，聚類I樣品的豐度要非常顯著高于聚類II（P＜0.01），但香農指數間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 基于門、屬和OTU水平上細菌群落組成分析

經序列比對發現，奶疙瘩樣品中共存在5個細菌門和28個細菌屬，在門和屬水平上優勢菌含量如圖3所示。

圖3 優勢細菌門（a）和屬（b）相對含量的氣泡圖

由圖3可知，Firmicutes（硬壁菌門）是奶疙瘩樣品中的優勢細菌門，相對含量高達99.26%，Lactobacillus（乳酸桿菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬）是優勢細菌屬，相對含量分別是87.59%和9.48%。本研究亦發現Lactococcus（乳球菌屬）雖不是優勢菌，但其在各樣品中的平均相對含量為0.33%。上述3類菌屬均屬于乳酸菌，由此可見，乳酸菌為奶疙瘩中的優勢細菌，累計相對含量高達97.4%。同樣采用Illumina MiSeq高通量測序技術，王春艷對伊犁牧區傳統手工奶酪（即奶疙瘩）細菌多樣性進行了研究，結果發現Lactobacillus（乳酸桿菌屬）的相對含量僅為9.17%，樣品中的優勢細菌還包括Ralstonia（雷爾氏菌屬，30.41%）、Staphylococcus（葡萄球菌屬，6.32%）和Acinetobacter（不動桿菌屬，4.62%）等[15]。通過Moon-Median檢驗發現，聚類I與聚類II樣品在優勢門和屬上均無明顯差異（P＞0.05）。

本研究共劃分了4 228個OTU，但僅有18個OTU存在于所有樣品中，包含了196 613條序列，占總序列數的85.15%。由此可見，8個奶疙瘩樣品中共有大量的核心細菌類群。核心OTU中有6個鑒定為Lactobacillus（乳酸桿菌屬）、5個鑒定為Streptococcus（鏈球菌屬）、2個鑒定為Acetobacter（醋桿菌屬），但有5個無法鑒定到屬水平，只能確定其隸屬于乳桿菌目（Lactobacillales）。不同核心OTU的平均相對含量亦存在較大的差異，如OTU3705（隸屬于乳酸桿菌屬）所包含序列數占總序列數的56.60%，而OTU3565（隸屬于醋桿菌屬）所包含序列數僅占總序列數的0.02%。本研究選取包含序列數平均相對含量大于1.0%的OTU構建了柱狀圖，結果如圖4所示。

圖4 包含序列數相對含量大于1.0%核心OTU的柱形圖

由圖4可知，有3個核心OTU所包含序列數平均相對含量大于1.0%，分別為OTU3705、OTU4026和OTU1780，含量分別為56.60%、18.76%和7.56%，其中OTU1780被鑒定為Streptococcus（鏈球菌屬），而其他2個OTU被鑒定為Lactobacillus（乳酸桿菌屬）。上述結果進一步證實了8個奶疙瘩樣品中共有大量的核心細菌類群，3個核心OTU的累計平均相對含量即高達82.92%，且乳酸菌為奶疙瘩中的優勢細菌。OTU4026在聚類I樣品中累計平均相對含量僅占0.75%，而在聚類II樣品中為36.77%，經Moon-Median檢驗發現兩者差異非常顯著（P＜0.01），而其余2個OTU在不同聚類樣品間的差異均不顯著（P＞0.05），這也進一步證實了在OTU水平上存在一定差異可能是導致8個奶疙瘩樣品劃分為2類的原因之一。

導致8個奶疙瘩樣品劃分為2類的原因還可能與在若干相對含量較低的細菌類群上存在一定差異有關。聚類I和聚類II中特有OTU的平均相對含量如表1所示。

表1 聚類I和聚類II中特有OTU的平均相對含量

由表1可知，聚類I樣品中含有37個特有OTU，其中34個鑒定為Lactobacillus（乳酸桿菌屬），平均相對含量為4.756%，各有1個特有OTU鑒定為Acetobacter（醋桿菌屬）、Streptococcus（鏈球菌屬）和Salmonella（沙門氏菌屬），但其平均含量僅為0.266%、0.084%和0.051%。由表1亦可知，聚類II樣品中含有2個特有OTU，分別被鑒定為Lactobacillus（乳酸桿菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬），平均相對含量僅為0.047%和0.030%。由此可見，雖然不同聚類樣品間存在部分獨特的細菌類群，但其含量相對較少。

2.3 奶疙瘩樣品的PICRUSt基因功能預測

結果見圖5。

圖5 基因功能預測熱圖

由圖5可知，所有序列共預測到3 728個COG，分別隸屬于23個功能大類，其中碳水化合物及氨基酸運輸和代謝的功能相對高表達。中、短碳鏈的脂肪酸、酯類和醛類化合物為新疆地區奶疙瘩中主要的揮發性化合物[16]，其中酸類化合物與氨基酸分解有關，會賦予奶制品特有的乳臭風味[17]；發酵過程中氨基酸代謝產生的伯醇和仲醇可以與短鏈脂肪酸或中長鏈脂肪酸發生酯化反應，產生大量的酯類化合物[18]；而醛類化合物的生成亦與氨基酸的轉氨作用有關[19]。由此可見，氨基酸代謝與奶疙瘩揮發性風味物質的形成具有較大影響，這也可能是奶疙瘩樣品中細菌氨基酸運輸相關功能基因高表達的原因。經Moon-Median檢驗發現，聚類I和聚類II樣品間細菌各功能基因的表達差異均不顯著（P＞0.05）。

3 結論

本研究使用Illumina MiSeq高通量測序技術，對采自伊犁地區的干奶疙瘩樣品微生物多樣性進行了解析，發現雖然不同奶疙瘩樣品在若干相對含量較低的細菌類群上存在一定差異，但Lactobacillus（乳酸桿菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬）是各樣品中的優勢菌屬。不同奶疙瘩樣品存在大量的共有細菌類群，該類群亦屬于Lactobacillus（乳酸桿菌屬）和Streptococcus（鏈球菌屬），且具有較強的碳水化合物及氨基酸運輸和代謝的功能。通過本研究的實施可為后續新疆地區奶疙瘩工業化生產和傳統發酵乳制品的微生物解析提供一定的數據支持。