富硒酵母破壁靈芝孢子粉的功能及安全性研究

辛成龍

（山東省疾病預防控制中心，山東濟南 250000）

硒為人體必需的元素之一，是谷胱甘肽過氧化物酶的組成部分，可以維持酶活性，富硒酵母為硒的補充制劑，其應用廣泛，為《保健食品原料目錄（一）》中明確載明的保健食品原料之一，具有食用安全性，且經科學證明，其具有增強機體免疫力的功能[1-3]。張國蓉等[4]研究了富硒酵母對小鼠免疫功能的影響，實驗結果證明富硒酵母能夠顯著提高小鼠T和B淋巴細胞轉化率、自然殺傷細胞（NK細胞）活性和巨噬細胞的吞噬功能。

破壁靈芝孢子粉為衛法監發（2001）84號載明的可用于保健食品的真菌菌種名單中的靈芝孢子破壁而得。靈芝（Ganoderma lucidum）是我國傳統中藥，具有補氣安神、止咳平喘等功效。靈芝孢子是靈芝在生長成熟期，從靈芝菌褶中彈射出來的卵形生殖細胞，主要有效成分包括多糖、三萜、生物堿和甾醇等，具有抗腫瘤、增強免疫力等作用[5-7]，其經破壁之后，能促進機體對其的吸收，從而大大提高功效。楊國光等[8]分別給予昆明種小鼠3種不同破壁方法的靈芝孢子粉，發現對小鼠給予3種破壁靈芝孢子粉30 d后，小鼠的遲發型變態反應、脾淋巴細胞轉化水平、細胞抗體生成水平、血清溶血素抗體滴度水平、碳廓清吞噬功能均有不同程度的提高，表明3種破壁靈芝孢子粉均具有增強免疫力的作用。黃邵新等[9]探討了靈芝孢子粉對小鼠免疫功能的影響，給藥小鼠半數溶血值、血碳清除率、足跖厚差、脾臟指數與正常對照組相比差異顯著，表明靈芝孢子粉可較全面地提高小鼠的免疫功能。富硒酵母、破壁靈芝孢子粉二者配伍，可協同促進增強機體免疫力?，F為證明二者的復方產品具有增強免疫力功效及安全性，進行動物實驗。

1 材料與方法

1.1 樣品

復方富硒酵母破壁靈芝孢子粉，2.5 g/袋，組方為富硒酵母（Se含量為0.5%）0.09 g、破壁靈芝孢子粉1.90 g、果粉0.51 g；每日2次，每次1袋。羊血、印度墨汁，由上海信裕提供。

1.2 試驗動物及分組

由山東大學動物試驗中心提供的ICR小鼠200只，SD大鼠80只，清潔級，♀♂兼用（每項功能試驗均使用單性別小鼠），生產許可證號為SCXK（魯）20130009，試驗動物使用許可證號為SYXK（魯）20100011號。試驗動物飼料生產許可證SCXK（京）2014-0008。飼養環境為屏障級。試驗環境溫度（22±2）℃，相對濕度50%±10%。功能試驗中，將160只小鼠按體質量分為4個免疫大組，每大組40只，每免疫大組小鼠分為水對照組以及上述樣品低、中、高劑量組，各10只。免疫一組（雌）用于遲發型變態反應（DTH）實驗、血清溶血素的測定、抗體生成細胞數的測定；免疫二組（雌）用于小鼠碳廓清實驗；免疫三組（雄）用于小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗；免疫四組（雄）用于小鼠淋巴細胞轉化實驗和小鼠自然殺傷細胞（NK細胞）活性測定。

1.3 試驗劑量

本樣品人體推薦劑量為5.0 g/日，人體按體重60 kg計，設置低、中、高3個劑量組，分別為0.42 g/kg.BW、0.83 g/kg.BW、2.5 g/kg.BW，相當于人體推薦劑量的5倍、10倍、30倍，經口給予受試物，每日灌胃一次，灌胃體積按20 mL/kg.BW。灌胃前用蒸餾水配制受試物，對照組以等體積的蒸餾水代替受試物，連續給予30 d后檢測各項免疫指標。小鼠以遠交系小鼠專用飼料喂飼。

1.4 儀器設備

ACS-3A動物天平，上海越衡；Bp-3100S分析天平，德國賽多利斯；WIGGENS WCI-180N CO2培養箱，伊孚森中國；RTS-0506恒溫水浴，南京舜瑪；Mikro-22臺式離心機，德國赫提馳；P9雙光束紫外分光光度計，上海美譜達；MR-96A酶聯免疫檢測儀，深圳邁瑞；光學顯微鏡，無陌光學；JC-ZF-RE5000旋轉蒸發儀，聚創環保。血細胞計數器、24孔和96孔平底細胞培養板、96孔U型底細胞培養板、計時器、血色素吸管、游標卡尺（精密度0.01 mm）。

1.5 試驗方法

1.5.1 臟器體重比值測定

小鼠稱重后頸椎脫臼處死小鼠，取其胸腺、脾臟，經處理后稱重，計算胸腺體重比值與脾臟體重比值。

1.5.2 遲發型變態反應

取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經腹腔注射2%（V/V，用生理鹽水配制）壓積綿羊紅細胞SRBC（2 000 r/min，10 min）0.2 mL，致敏后 4 d，測量左后足跖部厚度，同一部位測量3次，取其平均值。然后在測量部位皮下注射20%（V/V，用生理鹽水配制）壓積SRBC 20 μL，于注射后24 h測量左后足跖部厚度，以攻擊前后足跖厚度之差值（足跖腫脹度）來表示DTH的程度。

1.5.3 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗（MTT法）

小鼠喂養30 d后無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，制成細胞懸液，分為兩份，一份加入ConA液，另一孔作為對照組。每份加入酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解，在570 nm波長處測定其吸光度值（A值）。計算試驗孔A值與對照孔A值之差，以此表示淋巴細胞的增殖能力。

1.5.4 抗體生成細胞測定（Jerne改良玻片法）

取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經腹腔注射壓積SRBC，將SRBC免疫5 d后的小鼠處死，取脾，制成細胞懸液，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，進行培養箱孵育、溫育后，計數溶血空斑數。

1.5.5 小鼠血清溶血素的測定

取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經腹腔注射壓積SRBC，免疫5 d后，摘除小鼠眼球取血離心，將凝固血與管壁剝離，收集血清，孵育，記錄血球凝集程度，計算抗體積數。

1.5.6 小鼠碳廓清實驗

小鼠尾靜脈注射1∶5稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計時，注入墨汁后2 min、10 min，分別從內眥靜脈叢取血20 μL，并將其加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。用紫外分光光度計在600 nm波長處測吸光度值（A），以Na2CO3溶液作空白對照。將小鼠處死，取其肝臟和脾臟稱重。按公式（1）計算吞噬指數a，其中k根據公式（2）計算。

式（2）中，A1為t1時刻的測得的吸光度，A2為t2時刻測得的吸光度。

1.5.7 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（半體內法）

小鼠腹腔注射20%壓積雞紅細胞懸液，頸椎脫臼處死，取腹腔巨噬細胞洗液孵箱溫育、漂洗、晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4% Giemsa-磷酸緩沖液染色5 min，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計數，每片計數100個巨噬細胞，按公式（3）和公式（4）計算吞噬率和吞噬指數。

所得數據為計量資料，吞噬百分率需按X=Sin-1進行數據轉換，式中P為吞噬百分率，用小數表示。

1.5.8 小鼠NK細胞活性測定[乳酸脫氫酶（ LDH）測定法]

將小鼠脫臼處死，無菌取脾，制備脾細胞懸液，用Hank's液洗，離心，重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數（活細胞數應在95%以上），調整細胞濃度為2×107個/mL，使效靶比為50∶1。取靶細胞和脾細胞各100 μL，加入U型96孔培養板，靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100 μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%乙基苯基聚乙二醇（NP40）各100 μL，上述各項均設3個平行孔，37 ℃、5% CO2培養箱培養4 h，將96孔板以1 500 r/min離心5 min，每孔吸取上清液100 μL置96孔培養板中，同時加入LDH基質液100 μL，反應10 min，然后每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL終止反應，用酶標儀在490 nm處測定A值，按公式（5）計算NK細胞活性。

1.5.9 毒理試驗

（1）小鼠急性毒性試驗

采用最大耐受劑量法試驗，小鼠灌胃前16 h禁食（自由飲水），于第2 d以20.0 g/kg.BW灌胃受試物后，連續觀察14 d，并及時記錄小鼠的中毒癥狀、死亡情況。

（2）大鼠30 d喂養試驗

選擇80只SD大鼠，按體重隨機分成4組，每組20只，雌雄各半。設2.5 g/kg.bw、5.0 g/kg.bw、10.0 g/kg.bw三個劑量組，另設1個陰性對照組，連續觀察30 d。

1.6 數據處理

所得數據為計量資料，用SPSS統計軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 遲發型變態反應、脾指數和胸腺指數

由表1可見，經口給予小鼠不同劑量的受試物后，水對照組和3個劑量組共4個組的脾臟體重比值和胸腺體重比值的方差分析結果顯示，各組均數間差異不顯著（P＞0.05），即受試物對小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值均無影響。水對照組和3個劑量組共4個組的小鼠足跖腫脹度的方差分析結果顯示，各組均數間差異顯著（P＜0.05），用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計學分析，其足跖腫脹度在對照組和低劑量組間比較無顯著性差異（P＞0.05），在對照組與中、高劑量組間比較有顯著性差異（P＜0.05），可以認為受試物有提高小鼠遲發型變態反應的能力。

2.2 脾淋巴細胞轉化和NK細胞活性

由表2可見，水對照組和3個劑量組共4個組的NK細胞活性和脾淋巴細胞轉化實驗結果顯示，各組均數間無顯著性差異（P＞0.05），因此，尚不能認為受試物有提高小鼠淋巴細胞增殖和NK細胞活性的能力。

2.3 體液免疫功能

由表3可見，水對照組和3個劑量組共4組的方差分析結果顯示，溶血空斑各組均數間比較差異有顯著性（P＜0.05），其抗體生成細胞數在對照組和低劑量組間比較無顯著性差異（P＞0.05），在對照組與中、高劑量組間比較有顯著性差異（P＜0.05），可以認為受試物有提高小鼠抗體生成細胞數的能力；水對照組和3個劑量組共4個組的抗體積數的方差分析結果顯示，各組均數間比較無顯著性差異（P＞0.05），尚不能認為受試物有提高小鼠血清溶血素水平的能力。

2.4 單核-巨噬細胞功能測定

由表4可見，水對照組和3個劑量組共4個組的碳廓清實驗吞噬指數的方差分析結果顯示，各組均數比較有顯著性差異（P＜0.05），對多個實驗組和一個對照組間均數進行兩兩比較并進行統計學分析，其吞噬指數在對照組和低、中劑量組間比較無顯著性差異（P＞0.05），在對照組和高劑量組間比較有顯著性差異（P＜0.05），可以認為受試物高劑量組可增加小鼠單核-巨噬細胞的碳廓清能力。吞噬實驗吞噬指數的方差分析結果顯示，吞噬指數各組均數間差異不顯著（P＞0.05），尚不能認為受試物具有促進小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬能力。

表1 遲發型變態反應、脾指數和胸腺指數實驗結果（n=10）

表2 NK細胞活性和脾淋巴細胞轉化實驗結果（n=10）

表3 溶血空斑和溶血素實驗結果（n=10）

表4 碳廓清實驗與吞噬實驗結果（n=10）

2.5 毒理試驗

2.5.1 小鼠急性毒性試驗

小鼠急性毒性試驗見表5。實驗中未見明顯中毒癥狀，且各組均未見死亡情況。最大耐受量法試驗結果顯示，該受試物對兩種性別小鼠的最大耐受劑量MTD均大于20.0 g/kg.BW。根據急性毒性分級標準，該受試物屬實際無毒級。

表5 急性毒性試驗結果

2.5.2 大鼠30 d喂養試驗

試驗期間，大鼠的活動、攝食、飲水和排便等一般狀況均正常，無明顯中毒癥狀及死亡情況；各受試物劑量組的體重、進食量、食物利用率、血常規、血液生化指標以及肝/體比、腎/體比、脾/體比指標與對照組比較，差異均無統計學意義，由此表明，該項試驗結果為陰性。

3 結論

富硒酵母、破壁靈芝孢子粉二者組方配伍，對小鼠體重增長無不良影響，對小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值無影響，體液免疫、細胞免疫功能測定結果均為陽性，單核-巨噬細胞吞噬功能、NK細胞活性測定結果為陰性，且毒理試驗證明本品安全無毒。根據《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003版）對增強免疫保健食品的判斷標準，其可以增強小鼠免疫功能，具有調節免疫力功能。