人參皂苷Compound K制備工藝優化

袁留生，周偉

（1.復旦大學 生命科學學院，上海 200438；2.復旦大學 化學系，上海 200032）

人參皂苷Compound K（CK）是天然的二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rc等在人腸道內的代謝產物[1]，目前主要通過微生物轉化或糖苷酶水解制備[2]。作為一個多靶點、高活性化合物，CK具有非常廣闊的應用前景和開發價值[3]。本課題組Zhou和Yan等人在前期研究中已經建立了較完整的微生物轉化制備工藝[4-5]，但目前的工藝還存在較多不足之處，如摩爾轉化率還不夠高，轉化底物的普適性還有待拓展，硅膠柱純化工藝成本高、收率偏低，最終產品的純度較低，還達不到原料藥純度（98%）等，所以工藝有待進一步優化。本研究在前期研究的基礎上，通過對發酵條件的進一步優化，并建立新的純化工藝，以進一步提高CK成品的收率和純度。

1 材料與方法

1.1 材料

三七莖葉總皂苷，紅云生物技術有限公司；三七二醇總皂苷，云南香格喜瑪生物技術有限公司；人參皂苷CK標準品，實驗室自制（純度＞99%）。

主要培養基由葡萄糖、蔗糖、酵母粉、花生粉、大豆蛋白、玉米麩皮、黃豆粉，瓊脂粉、麩皮粉構成，由浙江海正藥業股份有限公司提供。

(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2、乙醇、甲醇、丙酮和磷酸等，分析純，購自國藥集團（上?；瘜W試劑有限公司）；甲醇、乙腈，HPLC級，購自Thermo Fisher（美國）；95%工業乙醇，購自滄盛化工有限公司（河北）。大孔樹脂D101、H41、S80、H60、AB-5，購自天津浩聚樹脂科技有限公司；GF254薄層色譜硅膠預制板，購自上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 設備

1100系列高效液相色譜儀，配有四元梯度泵、自動進樣器和可變波長掃描紫外檢測器，Agilent USA；10 L全自動發酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；ZWY-211G旋轉式搖床，上海智城分析儀器制造有限公司；FE20實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZHJH-1112C型超凈工作臺，上海智城分析儀器制造有限公司；FA1104型分析天平，上海橫平儀器儀表廠；OSB-2100旋轉蒸發儀，EYELA Japan；

1.3 菌株

擬青霉菌Paecilomyces Bainier sp.229，本實驗室保藏。

1.4 試驗方法

1.4.1 HPLC分析方法

1.4.1.1 人參皂苷CK分析方法

色譜柱：C18（Agilent XDB，4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈∶水=48∶52；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

1.4.1.2 人參皂苷Rb1分析方法

色 譜 柱：C18（Agilent SB，4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相：乙腈-水梯度洗脫，0～21 min，27%～35%（乙腈）；21～24 min，35%～50%（乙腈）。流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

1.4.2 不同皂苷底物的比較

對三七二醇型皂苷中Rb1的含量進行HPLC檢測；分別對三七莖葉總皂苷和三七二醇型皂苷這兩者的發酵轉化結果進行比較，以選擇更優的轉化底物[6]。

1.4.3 發酵培養基和底物投料方式的優化

在前期研究中發現氮源選擇對發酵結果的影響較大，效果較好的氮源有黃豆餅粉、花生餅粉和酵母粉。如表1所示，設置3組發酵培養基[7]。合適的底物誘導對糖苷酶的產生有較大的影響，如表2所示，試驗中以優選的皂苷為轉化底物，設計了4種誘導方式。通過不同發酵培養基的組合并結合不同的底物誘導和投料方式進行比較篩選。

1.4.4 10 L罐上發酵條件優化

采用優選的發酵培養基和底物投料方式，利用全自動發酵罐的功能優勢，對發酵過程中的溶氧和轉化溫度等關鍵點進行精確控制優化。通過轉速調節，控制發酵初期和轉化后期的溶氧水平，以觀察溶氧對轉化的影響；通過對菌體生長和加入底物后轉化期間的溫度控制，以觀察溫度對轉化的影響。

1.4.5 大孔樹脂的篩選

大孔吸附樹脂是一種具有多孔立體結構的聚合物吸附劑，具有物理化學性質穩定、吸附選擇性獨特、解吸條件溫和、再生簡便、有機溶劑用量少以及成本較低等優點，廣泛用于人參皂苷的純化[8-9]。本研究分別對D101、H41、S80、H60、AB-8五種大孔樹脂進行篩選，比較分離后目標樣品的純度，并計算回收率。

表1 發酵培養基組成

表2 誘導方式

1.4.6 洗脫條件的優化

以優選的大孔樹脂在相同的上樣條件下采用不同的洗脫溶劑和比例，進行洗脫條件的優化。篩選的洗脫條件包括：（1）55%丙酮洗滌，65%丙酮洗脫；（2）50%乙醇洗滌，70%乙醇洗脫；（3）50%乙醇洗滌，80%乙醇洗脫。

1.4.7 結晶工藝優化

采用甲醇、甲醇-水、丙酮、丙酮-水、乙醇的溶劑體系對CK進行結晶[10]，比較不同溶劑體系對純度和收率的影響，篩選最佳的結晶工藝。

2 結果與分析

2.1 不同皂苷底物的比較

2.1.2 三七二醇型總皂苷底物Rb1含量的檢測

通過HPLC方法對三七二醇型總皂苷中Rb1含量進行檢測，如圖1所示，可以看到三七二醇型總皂苷中Rb1含量高，更適合用于CK的制備，其他皂苷的種類少、含量低。

圖1 三七二醇型皂苷HPLC圖譜

2.2 不同皂苷底物CK轉化率比較

三七莖葉總皂苷CK摩爾轉化率為28.8%±1.38%，三七二醇總皂苷CK摩爾轉化率為71.70%±1.52%。如圖2所示，對兩種不同轉化底物的發酵液采用乙醇提取后，經HPLC檢測分析，三七二醇型皂苷比三七莖葉總皂苷轉化所產生的雜質明顯要少，而三七莖葉總皂苷轉化產物中6.522 min處存在一個含量比較高的副產物，會嚴重影響CK的分離純化收率。從以上結果可知，三七二醇型總皂苷Rb1含量高，轉化率高，經轉化后產生的雜質組分少，有利于后續純化工藝，是制備CK優選的轉化底物。

圖2 不同皂苷底物CK轉化HPLC圖譜

2.3 發酵培養基和底物投料方式的優化

從表3可知，在所考察的氮源中，3%酵母粉和0.5%玉米麩皮相比于其他氮源組合對轉化更有利。根據摩爾轉化率數據，提前誘導相較于直接投料可以顯著提高CK轉化率，在生長24 h左右進行誘導，以0.1%的誘導量最好，摩爾轉化率達到了81.9%。

表3 不同發酵條件下的轉化率結果

2.4 10 L罐上發酵條件優化

2.4.1 溶氧調節

發酵初期，溶氧快速下降，發酵24 h，發酵液粘稠，溶氧＜5%，不利于菌體生長。因此在4.5 h溶氧達到設定值30%時，開始關聯轉速，以盡量減慢溶氧下降速度，轉化率提高至85%左右。

2.4.2 溫度控制

考慮到后期菌體自溶比較嚴重，降低了轉化溫度，由32 ℃降低為28 ℃，并通過降低轉速來降低后期溶氧和剪切力。圖3表明，該法十分有效，轉化率上升至91.8%。

2.4.3 大孔樹脂的選擇

圖3 10 L發酵罐發酵曲線

采用40 mm×500 mm規格的層析柱分別裝填D101、H41、S80、H60、AB-8五種大孔樹脂填料，控制裝填高度40 cm，裝填填料體積500 mL。純化過程中收集目標組分，經HPLC檢測，計算純度和回收率。從表4可知，H41相比較其他弱極性或低極性大孔樹脂有更好的分離效果，經純化后目標CK產品純度為93.2%，回收率為78.3%，所以最終確定H41為工藝優選的填料。

表4 不同類型大孔樹脂篩選純化結果

2.5 洗脫條件的優化

以H41柱，采用乙醇替代丙酮進行洗脫條件的優化，計算純度和回收率。由表5可知，乙醇作為洗脫溶劑與丙酮相比，產品純度和回收率接近，因此可以采用乙醇替代丙酮作為洗脫溶劑，優選的洗脫條件為：采用與上樣樣品相同的50%乙醇濃度進行洗滌，80%乙醇進行洗脫。

2.6 結晶工藝優化

考察不同結晶溶劑包括甲醇、甲醇-水、丙酮、丙酮-水、乙醇-水等的結晶效果。結果發現，CK在以上溶劑中均有較好晶型。其中，CK在甲醇-水中結晶速率快、收率高、晶形好、純度高。CK濃度未100 mg/mL，甲醇與水的比例為100∶65的條件下，具有最好的結晶效果，一次結晶純度達到96.8%。在甲醇-水體系中再增加一次重結晶，CK純度便可進一步提高，達到了98.1%以上。

表5 不同洗脫條件篩選的純化結果

2.7 純化工藝重復驗證

按照以上工藝，進行連續三批的放大生產，單批純化300 mL乙醇濃縮液（CK濃度22.5 mg/mL），最后所得CK成品的純度和純化總收率如表6所示，中間品HPLC譜圖如圖4所示。從結果可知，三批放大生產結果穩定，CK成品純度達到了化學原料藥大于98%的標準。

表6 三批次純化結果

圖4 CK純化中間品HPLC圖譜

3 結論

三七二醇型總皂苷發酵轉化率高，且經轉化后產生的雜質組分少，是制備CK優選的轉化底物；3%酵母粉和0.5%玉米麩皮相比其他氮源組合對轉化更有利；根據摩爾轉化率數據，提前誘導相比直接投料可以顯著提高CK轉化率；在10 L發酵罐上通過控制發酵前期和后期的溶氧并降低轉化溫度，取得了良好的效果，CK摩爾轉化率進一步提高，達到了91.8%。建立的大孔樹脂純化新工藝，較之前的硅膠柱分離更簡單可行，成本更低；并通過重結晶，最終使CK成品純度較原工藝有顯著提高，達到98%以上，純化總收率可保持在70%左右。整個發酵和純化工藝易于放大，為將來CK的新藥研發和產業化進一步奠定了基礎。