通過側鏈結構修飾將三尖杉寧堿轉化為紫杉醇的工藝研究

李健，賴平安

（1.桂林吉福思羅漢果有限公司，廣西桂林 541006；2.桂林暉昂生化藥業有限責任公司，廣西桂林 541004）

紫杉醇（Paclitaxel）是從紅豆杉科紅豆杉屬植物中分離得到的一種四環二萜生物堿，Schiff等[1]發現其在促進微管蛋白的聚合以及防止解聚具有良好的作用。美國食品和藥物管理局（FDA）于1992年正式批準其用于臨床治療晚期卵巢癌，之后其臨床應用范圍逐漸擴展至乳腺癌、肺癌、頭頸癌、前列腺癌等多種癌癥的治療，是多年來治療癌癥的藥物中療效最為顯著的化療藥物之一。

迄今為止，紫杉醇主要是從紅豆杉屬植物的枝葉或莖皮中提取得到，但由于紅豆杉中的紫杉醇含量極低，純天然來源的紫杉醇很難滿足患者需求。為此，研究人員嘗試開展了多種其他來源的紫杉醇制備方法的研究。其中，利用紅豆杉中的杉烷類似物為前體，經過半合成方式獲得紫杉醇及其衍生物是目前最有效的方法之一[2]。三尖杉寧堿（Cephalomannine，CE）是紅豆杉中的紫杉烷類成分，其成分結構與紫杉醇的差異僅在C13位側鏈上NH-的連接基團。在目前國內人工種植的主要紅豆杉品種南方紅豆杉中，三尖杉寧堿在樹枝和樹葉中的含量達392.69 μg/g和75.31 μg/g，遠高于同部位中紫杉醇的含量77.03 μg/g和64.82 μg/g[3]。枝葉是紫杉醇提取可再生紅豆杉資源的關鍵部位，人們在以南方紅豆杉枝葉提取分離得到紫杉醇的同時，會得到比紫杉醇產量更大的主含三尖杉寧堿的副產物，如果能以簡單且低成本的工藝將其轉化為紫杉醇及其衍生物，將會大幅提高紅豆杉資源的利用率，降低生產成本。

有專利提供了一種方法，將寧堿側鏈的酰胺通過Schwartz's試劑轉化為氨基[4-6]，然后酰化氨基獲得紫杉醇及其他類似物，但該法使用的Schwartz's試劑較為昂貴，市場上并不容易獲得，且反應條件要求很高，不利于實際的生產應用。本研究同樣以紫杉烷側鏈的酰胺基的裂解方法作為研究對象，發現以頭孢菌素C為原料制備7-氨基頭孢烷酸的化學裂解工藝原理[7]是可以被借鑒并應用在紫杉烷側鏈酰氨基的裂解以獲得可以被選擇性酰化的活性氨基，并以此為基礎，設計了對應的合成工藝，成功將三尖杉寧堿通過側鏈的結構改造使之轉化為紫杉醇。

1 合成路線設計

以三尖杉寧堿作為起始原料，通過三氯化鈰作用對側鏈的C2’-OH進行選擇性苯甲酰化[8]，然后以氯甲酸三氯乙酯對C7-OH進行酰化使接上保護基團，再對側鏈上的酰氨基進行鹵化反應和醇解使獲得活性氨基，然后通過提供適合的條件使C2’-O位的苯甲酰基發生重排反應遷移到氨基上，最后脫保護反應獲得紫杉醇[9]。整個反應路線不需要引入昂貴的側鏈，反應條件簡單可控，可根據目標產物需求調整C2’-OH的酰化基團，實現氨基N-連接基團差異化的紫杉烷類似物的制備。具體的合成路線見圖1。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

DLSB-20/40低溫冷卻循環泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；Waters2695高效液相色譜儀，沃特世科技有限公司（Waters）；IRPrestige-21傅立葉變換紅外光譜儀，日本島津；UV-3600Plus紫外分光光度計，日本島津；液相色譜/安捷倫6140液質聯用儀，安捷倫科技有限公司。

三尖杉寧堿色譜純度98%，由桂林暉昂生化藥業有限責任公司提供；苯甲酸酐、丙酮、氯甲酸三氯乙酯、五氯化磷、1,2-丙二醇、吡啶、三乙胺和鋅粉為分析純試劑，購買自百靈威公司。

2.2 2'-O-Bz-三尖杉寧堿的合成

圖1

三尖杉寧堿50 g置干燥反應燒瓶中，加入400 mL經脫水處理的丙酮，攪拌溶解，加入1.25 g三氯化鈰，攪拌20 min后加入15 g苯甲酸酐，加熱使溶液溫度升至40～50 ℃。攪拌3 h，TLC（展開劑：CHCl3∶CH3OH=20∶1）監測反應進度，待原料斑點完全消失，反應完畢。加入飲用水稀釋后，以二氯甲烷萃取，有機層用水洗滌3次，分出有機層，濃縮；在濃縮液中加入200 mL石油醚，攪拌，靜置分層，傾出上清液，沉淀物干燥，以丙酮/石油醚重結晶得微黃色干燥粉末A 59.5 g，轉化率98%。產物在TLC展開劑條件下的Rf=0.64。產物氫譜數據為：1H-NMR（CDCl3，500MHz）：5.64（d，J=7.0Hz，1H）；3.85（d，J=7.0Hz，1H）；4.93（d，J=10.0Hz，1H）；2.54（ddd，J=6.9,9.5,15.0Hz，1H）；1.86（m）；5.55（m，1H）；6.31（s，1H）；6.21（t，J=8.0Hz，1H，）；2.3（m，1H）；1.14（s，3H）；1.26（s，3H）；1.86（s，3H）；1.79（s，3H）；4.32（d，J=8Hz，1H）；4.17（d，J=8Hz，1H）；5.65（d，J=2.8Hz，1H）；8.11（1H）；8.94（d，J=1Hz，2H）；6.35（m，2H）；7.92（t，J=6Hz，1H）；7.35～8.20（m，2H）；2.34（s，3H）；2.22（s，3H）；7.40～7.65（OBz）。波譜分析數據推斷產物A為2'-O-Bz-三尖杉寧堿。

2.3 2'-O-Bz-7-Troc-三尖杉寧堿的合成

稱取50 g產物A置反應燒瓶以250 mL二氯甲烷溶解，充入氮氣，滴加吡啶32.5 mL。攪拌30 min，緩慢滴加氯甲酸三氯乙酯42.5 g，持續攪拌2 h，TLC監控反應進度（展開劑：CHCl3∶C2H5OAC=9∶2），待原料A斑點消失，停止反應。往反應混合溶液中加入0.5 mol/L鹽酸水溶液250 mL，攪拌，靜置分層，有機層再以250 mL/次的0.5 mol/L鹽酸洗滌。分出有機層，減壓濃縮，往濃縮液中加入150 mL石油醚，攪拌使石油醚與濃縮液混合均勻，靜置，倒出上清液，底部沉淀物干燥，以丙酮/石油醚重結晶，得淡黃色粉末B 63.3 g，轉化率97%。產物在展開劑CHCl3∶C2H5OAC=9∶2條件下TLC的Rf=0.71。產物氫譜數據為1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：5.65（d，J=7.0Hz，1H）；3.95（d，J=7.0Hz，1H）；4.95（d，J=10.0Hz，1H）；2.54（ddd，J=6.9,9.5,14.9Hz，1H）；1.86（m）；5.65（m，1H）；6.35（s，1H）；6.17（t，J=8.0Hz，1H）；1.14（s，3H）；1.21（s，3H）；1.96（s，3H）；1.81（s，3H）；4.34（d，J=8Hz，1H）；4.17（d，J=8Hz，1H）；5.65（d，J=2.8Hz，1H）；8.15（1H）；8.95（d，J=1Hz，2H）；6.35（m，2H）；7.95（t，J=6Hz）；7.35～8.20（m，2H）；2.35（s，3H）；2.17（s，3H）；5.05（d，J=12，2H，OCOOCH2CCl3），7.40～7.65（OBz）。波譜分析數據與專利文獻[10]一致，推斷產物B為2'-O-Bz-7-Troc-三尖杉寧堿。

2.4 2'-O-BZ-7-troc-紫杉伯胺的合成

稱取15 g五氯化磷置于干燥反應燒瓶中，加入150 mL二氯甲烷，冷卻使溶液溫度降至-15 ℃，攪拌，向燒瓶中滴加50 mL吡啶，攪拌反應約30 min。稱取B產物50 g，以200 mL二氯甲烷溶解完全后緩慢加入反應燒瓶中，持續攪拌2 h。然后滴加1,2-丙二醇200 mL，加完后升高溫度，控制溫度在10 ℃反應，TLC（展開劑：CHCl3∶C2H5OAC=3∶1）監測反應進度，反應完畢，得到含有產物C（2'-Bz-7-Troc-紫杉伯胺）的反應混合液；產物在展開劑CHCl3∶C2H5OAC=9∶2條件下TLC的Rf=0.33。

2.5 7-Troc-紫杉醇合成

向含有產物C的反應混合液中加入250 mL二乙胺，使體系在堿性條件下攪拌反應2 h；TLC （展開劑：CHCl3∶C2H5OAC=3∶1）監控反應，待反應完畢，加入飲用水500 mL萃取，分出有機層，再以每次200 mL水洗滌3次，最后有機層再加入0.5 mol/L鹽酸，中和至水層pH值到5～6，分出有機層，濃縮干燥，以200目硅膠進行層析分離，以乙酸乙酯∶石油醚=3∶7為洗脫劑洗脫，收集純化層析液干燥得35.7 g D產物，“2.3”和“2.4”兩步反應綜合轉化率為77.2%。產物在展開劑CHCl3∶C2H5OAC=9∶2條件下TLC的Rf=0.65。產物的氫譜數據為1H-NMR（CDCl3，500MHz）：5.68（d，J=7.0Hz，1H，C2-H）；3.95（d，J=7.0Hz，1H）；4.95（d，J=10.0Hz，1H）；5.55（m，1H）；6.25（s，1H）；6.20（t，J=8.0Hz，1H）；1.17（s，3H）；1.26（s，3H）；1.85（s，3H）；1.84（s，3H）；4.36（d，J=8Hz，1H）；4.18（d，J=8Hz，1H）；4.85（d，J=3.0Hz，1H）；8.15（1H）；8.95（d，J=1Hz，2H）；6.36（m，2H）；7.95（t，J=6Hz，1H）；7.39-8.15（m，2H）；7.38～7.78（m，2H，NBz）；2.35（s，3H）；2.17（s，3H）；5.03（d，J=12，2H，OCOOCH2CCl3）。數據與專利文獻[11]一致，確認產物D為7-Troc-紫杉醇。

2.6 7-Troc-紫杉醇脫保護反應

將“2.5”項獲得的含D的7-Troc-紫杉醇反應產物的二氯甲烷溶液中加入80 mL 0.5 mol/L鹽酸，攪拌，加入15 g鋅粉，攪拌，水浴加熱使在35 ℃反應2 h。TLC（展開劑：CHCl3∶C3OH=20∶1）監測反應，待原料斑點消失，反應完畢。過濾除去鋅泥，濾液有機層用飲用水洗滌3次至水層呈中性，分出有機層，減壓濃縮、干燥。得到產物以200目硅膠進行層析分離，以C2H5OAC∶CHCl3=2∶8為洗脫劑洗脫，收集純化層析液，濃縮、干燥。干燥物以丙酮/石油醚重結晶得到白色晶體28.8 g，產物在展開劑CHCl3∶CH3OH=20∶1條件下的Rf=0.50，與紫杉醇對照品的Rf值一致；產物的液相色譜（流動相為甲醇∶乙腈∶水=22∶42∶36；色譜柱為HYPREPHS C18，5μm，250 mm×4.6 mm，λ=227 nm；流速為1.0 mL/min）分析圖譜中與紫杉醇對照品的出峰時間一致，色譜純度為98%，反應轉化率為96%。產物的氫譜數據為1H-NMR（CDCl3，500 MHz）：5.67（d，J=7.0Hz，1H）；3.79（d，J=6.5Hz，1H）；4.49（d，J=9.0Hz，1H）；2.54（ddd，J=7.0,9.5,15.0Hz，1H）；1.88（ddd，J=2.0,12.5,14.6Hz，1H）；4.39（dd，J=7.5,11.0Hz，1H）；6.27（s，1H）；6.23（t，J=9.0Hz，1H）；2.35（dd，J=9.0,15.5Hz，1H）；2.28（d，J=9.0,15.5Hz，1H）；1.14（s，CH3）；1.24（s，CH3）；1.79（s，CH3）；1.68（s，CH3）；4.30（d，J=8.5Hz，1H）；4.19（d，J=8.5Hz，1H）；4.79（d，J=2.0Hz，1H）；5.78（dd，J=2.5,9.0Hz，1H）；7.00（d，J=9.0Hz，NH）；8.13（d，J=7.5Hz，OBZ）；7.38～7.52（m，OBZ）；7.61（t，J=7.5Hz，OBZ）；7.38～7.52（m，Ph）；7.38～7.52（m，Ph）；2.38（s，OAC）；2.23（s，OAC）。

根據以上測試的光譜數據分析，產物的結構與紫杉醇文獻值[12～13]比較，二者基本一致，確認工藝合成的樣品為紫杉醇。從起始原料三尖杉寧堿開始，至獲得紫杉醇的綜合轉化率約為70.5%。

3 結果與討論

3.1 工藝路線關鍵步驟分析

3.1.1 關于2'-O-Bz-三尖杉寧堿的合成

反應中的Ce3+在酰化反應體系中分別與C7-OH和C9=O形成特定螯合結構從而保護C7-OH不被酰化而只對C2’-OH位進行酰化的特性[8]，以很高的反應轉化率獲得C2’-O-Bz-三尖杉寧堿。

3.1.2 2'-O-Bz-7-Troc-三尖杉寧堿合成中羥基保護劑的選擇

反應原料三尖杉寧堿結構中存在較高活性的C7-OH，為避免在后續的反應中出現復雜的副反應，對C7-OH的保護是必要的。有機合成中羥基保護基團通常有三氯乙氧羰基（-troc），三乙基硅基（-Si(C2H5)3），叔丁氧羰基（-BOC）等，其對應的常用保護劑分別為氯甲酸三氯乙酯、三乙基氯硅烷、BOC酸酐。考慮到工藝路線設計中的后續反應，特別是側鏈酰胺基的鹵化、醇水解反應條件下三乙基硅基（-Si(C2H5)3）、叔丁氧羰基（-BOC）不穩定，因此采用氯甲酸三氯乙酯作為保護劑更合理。

3.1.3 2'-O-BZ-7-troc-紫杉伯胺與7-Troc-紫杉醇的合成

側鏈C3’位的戊烯酰胺進行裂解反應使形成活性氨基是關鍵步驟，本研究借鑒了頭孢菌素C為原料經化學裂解法制備7-氨基頭孢烷酸的工藝路線，利用五氯化磷對側鏈酰胺基的C1”-O進行氯化取代反應形成亞胺結構，然后與1,2-丙二醇進行醚化形成亞胺醚化物，該亞胺醚化物在醇環境中發生醇解形成紫杉伯胺產物。由于氯化反應過程劇烈，反應需要在-10～15 ℃進行以減少副反應的發生。在氯化反應后，筆者曾經選擇了甲醇、乙醇、正丁醇為醚化反應提供醇基，但反應轉化率較低，采用1,2-丙二醇后獲得了較高的得率，其原因仍有待進一步分析。

工藝路線中另一重要步驟是C2’-O位的苯甲酰基在前述醇裂解反應獲得C3’-NH2后，在有機堿條件下發生重排轉移至氨基上，該反應在相關研究中[4-6]已獲得成功的應用。在本研究的工藝路線中，氯化反應體系中加入了一定數量的吡啶，因此酰基轉移反應實際在伯胺形成時就已經緩慢發生，但加入二乙胺后對提高反應速度和轉化率有很好的促進作用。

3.1.4 7-Troc-紫杉醇脫保護反應

對于羥基保護基（—Troc）的脫保護，常規的反應環境一般選擇在甲醇中加入冰醋酸和鋅粒（粉），這一反應環境有利于原料與酸、鋅反應產生的氫的充分接觸而實現脫保護。但筆者在研究中發現紫杉醇在甲醇加熱條件下，C7-OH容易發生差向異構化變成7-表-紫杉醇，因此，在該步驟的脫保護反應中嘗試了稀鹽酸水溶液/二氯甲烷的兩相反應體系。在攪拌足夠充分的情況下，脫保護反應進行順利，降低了目標產物紫杉醇的差向異構化風險。

3.2 工藝路線在合成其他紫杉烷類似物中的應用

本工藝路線的核心步驟是C3’位酰胺的裂解反應以形成活性的氨基C3’-NH2，而C2’-O位的酰基可根據目標產物的需要使用不同的酰化劑而獲得對應的基團，并在執行后續酰基轉移步驟時使其轉移至氨基上。如要獲得多烯紫杉醇在C3’位對應的叔丁氧甲酰胺基C3’-NH-BOC，則需要在對C2’-OH進行酰化時選擇BOC酸酐作為酰化劑。

當然，反應獲得活性氨基C3’-NH2后并不一定需要執行后續的C2’-O-位的酰基的轉移步驟，也可在獲得活性氨基后根據目標產物的需要對氨基直接進行酰化反應使形成酰胺基。

4 結論

本工藝路線采用的酰胺裂解反應工藝也可應用于具有C3’位酰胺基的其他紫杉烷類似物如10-去乙酰基三尖杉寧堿、7-表-三尖杉寧堿、紫杉醇C等的轉化。獲得的活性氨基也可根據需要通過酰化反應接上對應的酰基。