紅莓和黑莓葉黃酮類化合物抗氧化活性的比較研究

蔡成林，黃庭海，張青峰

（遵義醫科大學珠海校區，廣東珠海 519041）

我國樹莓資源豐富，根據果實成熟時的顏色，可以分為黑樹莓、黃樹莓和紅樹莓，果實中均含有黃酮類化合物，有著較強的抗氧化活性，無毒副作用，具有去除游離基、降低血壓、預防癌癥等明顯藥理效果。

本試驗從紅莓葉和黑莓葉中提取具有抗氧化作用的黃酮類化合物，并通過吸收光度減弱的程度來評價自由基被消除的情況。抗氧化劑除去游離基的作用愈好，代表抗氧化活性愈強。為了開發新的天然食品抗氧化劑，對它們的抗氧化活性進行了實驗對比。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品

蘆丁標準品，上海金穗生物科技有限公司；鹽酸，上海市氯堿化工股份有限公司；氫氧化鈉，廣州旭觀化工有限公司；亞硝酸鈉，武漢夢吉股份有限公司；硝酸鋁，太陽欣立上海分公司；無水乙醇，武漢市百利瑞化工有限公司；石油醚，浙江自貿易區正拓石油化工有限公司；雙氧水，山東瑞泰科技股份有限公司；鄰苯三酚，南京道斯夫科技有限公司；磷酸二氫鈉，濰坊市金海化工有限公司；鄰二氮菲，濟寧百川化工有限公司；羥基氨基甲烷，天津市大茂化學試劑廠；二丁基羥基甲苯（BHT），國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸（VC），浙江一諾生物科技有限公司。

1.2 實驗儀器

BSA124S精密電子天平，深圳市林濤儀器有限公司；C-20玻璃儀器氣流烘干器，上海貝侖儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵，上海霓玥儀器有限公司；HF-56數字恒溫水浴鍋，上海賀范儀器有限公司；7415紫外可見分光光度計，上海霓玥儀器有限公司；DFY-200C高速粉粹機，溫嶺市林大機械有限公司。

1.3 黃酮化合物的提取

紅莓、黑莓葉粉碎后烘干，精密稱量獲取10 g，分別放在500 mL圓底燒瓶之中，加入400 mL濃度為75%的乙醇溶液，在75 ℃的水浴之中提取1.2 h后真空抽濾，濾液加水稀釋至100 mL。

1.4 黃酮含量的測定

1.4.1 標準曲線測定

精密稱量獲取蘆丁10 mg，加適量75%的乙醇，微熱使之溶解，置100 mL容量瓶中定容，搖勻后放至自然冷卻，得到標準蘆丁乙醇溶液。分別取溶液 0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL置于50 mL容量瓶中，加5% NaNO21 mL,搖勻，放置6 min；加10% AI(NO3)31 mL，搖勻，放置6 min；加4% NaOH 8 mL，混勻，用75%乙醇稀釋至刻度，放置15 min后用紫外分光光度計在510 nm波長下測定吸光值，繪制標準曲線，如圖1所示。測得吸光度Y與濃度X的標準曲線方程為Y=10.561X-0.001 8，R2=0.999 5。

1.4.2 黃酮總含量的測定方法

利用分光光度計測定總黃酮含量，分別獲取提取液各0.2 mL于50 mL容量瓶中，用75%乙醇補充至25 mL，加5%的NaNO21 mL，放置6 min；加10%AI(NO3)31 mL，搖勻，放置6 min；加 4% NaOH 8 mL，混勻，用75%乙醇稀釋至刻度，放置15 min后用紫外分光光度計在510 nm波長下測定吸光值。記錄吸光值在0～1.0以內為有效。利用標準曲線計算黃酮總含量。

1.5 抗氧化性的檢測

1.5.1 羥基自由基清除率測定

于6只試管中各加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液、2 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，酸堿值7.4）和1 mL蒸餾水，充分混合均勻后加1 mL新配制的0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，混合均勻；6支試管中依次加入新配制的0.01%雙氧水、蒸餾水、0.2 mg/mL的紅莓總黃酮提取液、0.2 mg/mL的黑莓總黃酮提取液、二丁基羥基甲苯、維生素C各1 mL；于37 ℃水浴加熱1 h后，在536 nm處測吸光度，分別記為A1（試管中加入雙氧水的吸光度）、A2（試管中加入蒸餾水的吸光度）、A3（紅莓和黑莓葉提取液的吸光度）、AVC（維生素C的吸光度）、ABHT（二丁基羥基甲苯的吸光度），每組重復3次，根據公式（1）計算清除率。改變紅莓總黃酮提取液、黑莓總黃酮提取液、二丁基羥基甲苯、維生素C的濃度（1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL），測定不同濃度下的清除率。

1.5.2 超氧自由基抑制率測定

將Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）和鄰苯三酚溶液（45 mmol/L）分別水浴（25 ℃）10 min，各取5 mL混合后搖晃均勻，于325 nm即刻測量吸光度（A0），隔0.5 min再測一次吸光度，計算鄰苯三酚的自氧化率，自氧化速度控制在0.060～0.065 min-1，常規以測量確定3.5 min平均計。增加試樣后氧化率測量方法：取5 mL Tris—HCl緩沖液（pH 8.2），加入待測試樣5～20 μL，50 mol/L鄰苯三酚溶液5 μL，搖晃均勻，即刻測定吸光度值（A），每組重復3次，根據公式（2）計算超氧自由基抑制率。空白管為酸堿值為8.2的Tris—HCl緩沖液。

2 結果與分析

2.1 紅莓和黑莓提取液中黃酮總含量

如表1所示，紅莓、黑莓提取液黃酮總含量分別為14.2 mg/mL、18.6 mg/mL，且吸光度SD值表明實驗隨機誤差較小，實驗重現性較好。

表1 紅莓、黑莓提取液吸光度值及黃酮總含量

2.2 羥基自由基清除率的測定結果

由圖2知，紅莓和黑莓提取物對羥游離基有一定的除去效果，低濃度時清除效果不顯著，高濃度時清除效果較強，在一定濃度范圍內提取物濃度與清除率呈正相關；且羥基自由基清除率的大小為紅莓提取物＞黑莓提取物＞維生素C＞二丁基羥基甲苯。

圖2 黃酮類化合物清除羥基自由基能力的比較

2.3 超氧自由基清除率的測定結果

由圖3知，紅莓和黑莓提取物對鄰苯三酚自氧化形成的超氧負離子游離基有一定的除去效果。在一定范疇之內，提取物濃度與清除率呈現正相關態勢。低濃度時，對鄰苯三酚自氧化的約束效果較弱，但在較高濃度時，其約束效果明顯。

圖3 黃酮類化合物清除超氧自由基能力的比較

黃酮類化合物通過酚羥基與游離基反應產生較為平穩的半醌式自由基構造，使其具有抗氧化活性，羥基是否能產生較為平穩的游離基構造代表其抗氧化活性的強弱，決定其抗氧化活性的主要因素是B環上鄰二酚羥基的存在與否。2種莓葉提取液有著不一樣的抗氧化活性，是由酚羥基的代替區域所決定的。在2種黃酮提取物中以紅莓葉的黃酮類化合物除去游離基的效果最好，且在一定濃度范圍內呈線性關系。

3 結論

紅莓葉中黃酮類化合物含量高，具有良好的抗氧化活性，是一種很好的非人工抗氧化活性物質，可作為部分保健食品和化妝品的有效成分之一。該研究結果對促進紅莓葉資源的開發與利用具有一定的參考價值。