微生物試驗在化妝品防腐體系構建中的應用研究

陳廣棟，林錦雄，李秋英，冉亞妮，邱獻玲

（廣州艾蓓生物科技有限公司，廣東廣州 510850）

化妝品是在基質（水或油性原料）中添加各種有效成分經過多道生產工序制作而成的日用化學產品，常添加有水溶性高分子化合物、表面活性劑、防腐劑、香精等成分。因此，化妝品既能滿足消費者對美的追求，在生產、儲存、運輸、使用的過程中也很容易受到微生物的污染。在化妝品配方設計的過程中，防腐體系的構建是其中重要的一環，化學成分防腐劑構建的防腐體系雖然穩定高效，但刺激性與致敏率也相對較高，植物成分組配的防腐劑、無添加防腐劑因其低刺激性與致敏率逐漸成為化妝品防腐體系構建研究的熱門方向。在化妝品防腐體系構建過程中，為保證化學成分防腐劑、植物成分組配的防腐劑或無添加防腐劑所構建的化妝品防腐體系能夠滿足人們日常使用的要求，需要開展微生物試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化妝品樣品

試驗用化妝品制作過程經過嚴格的無菌控制，防腐劑成分及含量明確。

1.1.2 防腐劑

化學成分防腐劑：羥苯甲酯、羥苯丙酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲；植物成分組配防腐劑：明串球菌/蘿卜根發酵產物濾液、秦椒果提取物/朝鮮白頭翁提取物/須松蘿提取物；無添加防腐劑：辛酰羥肟酸（抗氧化劑）、對羥基苯乙酮（保濕劑）、己二醇（保濕劑）、戊二醇（保濕劑）、辛甘醇（螯合劑）。

1.1.3 試驗用菌種

細菌：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠色假單胞菌；酵母：白色假絲酵母；霉菌：黑曲霉。以上菌種均由廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.1.4 試驗用儀器

YXQ-LS-100SⅡ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；1244 Ⅱ級生物安全柜，美國BioX科技有限公司；LRH-250生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；BagMixer? 400拍打式無菌均質器，法國INTERSCIENCE公司。

1.1.5 試驗用培養基

大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）；D/E中和肉湯。

1.2 微生物試驗方法

1.2.1 試驗前增菌

細菌：從菌種斜面挑取并接種于TSA斜面上，在35 ℃下培養18～24 h；白色念珠菌：從菌種斜面挑取并接種SDA斜面上，在25 ℃下培養44～52 h；黑曲霉：從菌種斜面挑取并接種SDA斜面上，在25 ℃下培養6～10 d，或者更長的時間，以便獲得足夠的孢子[1-2]。

1.2.2 試驗接種菌液制備

用0.9% NaCl稀釋液洗脫細菌和白色念珠菌斜面并收集在相應的試管中。用添加0.5%吐溫80的0.9% NaCl稀釋液洗脫黑曲霉斜面，孢子懸浮液用無菌工具去除菌絲。用比濁法和血球計數法將細菌菌液濃度調節至約5.0×108CFU/mL，霉菌、酵母菌菌液濃度調節至約5.0×107CFU/mL。用平板法計數，此活菌計數結果用于計算接種后樣品初始菌液濃度，用lg值在結果報告中表示。細菌和酵母菌懸液在2 h內使用，貯存在2～8 ℃環境中24 h內使用，黑曲霉孢子懸液可在2～8 ℃環境中保存7 d。

1.2.3 防腐體系構建

如表1所示，構建18個防腐體系，進行微生物試驗。

1.2.4 樣品接種

在50 g樣品中分別加入上述制備好的（混合）細菌初始菌懸液100 μL，確保（混合）細菌在樣品中的接種濃度為1.0×106CFU/mL；另取50 g樣品分別加入上述制備好的（混合）霉菌初始菌懸液100 μL，確保（混合）霉菌在樣品中的接種濃度均為1.0×105CFU/mL。將接種菌液后的樣品用攪拌棒充分攪拌混勻后置于22.5 ℃保存。

表1 防腐體系構建

1.2.5 取樣測定

在接種后的0 d、7 d、14 d、21 d和28 d取樣進行測定，檢驗方法按化妝品安全技術規范[3]進行。

1.2.6 評價標準

盥洗用品和香精協會（CTFA）的方法規定初始的（混合）細菌和（混合）霉菌的接種量分別為106CFU/g(mL)和105CFU/g(mL)，要求在第7 d時細菌減少99.9%，霉菌減少90%，并且在28 d內菌數持續下降。美國藥典（USP）在CTFA評價方法的基礎上提出更為嚴格的標準：若單菌接種的3個平行試驗中任何一種微生物數量的平均值在第7 d時下降到100 CFU/g(mL)以下，28 d全部為0，則視為效果優良；通過試驗若第7 d天時下降到1 000 CFU/g(mL)以下，則視為勉強通過；若混菌接種的任何一種微生物，任何一個平行樣達不到上述標準，也達不到CTFA的要求，防腐體系則評定為無效[4-6]。

2 結果與分析

18個防腐體系對（混合）細菌和（混合）霉菌的抑殺作用見表2和表3。由表2和表3可知，化學成分防腐劑與植物成分防腐劑構建的化妝品防腐體系要優于無添加防腐劑，且無添加防腐劑構建的化妝品防腐體系沒有1例是優良的，表現并不理想；表2中第7號、13號樣品以及表3中第14號、17號樣品，其含菌量在加菌后第28 d均大于21 d時的含菌量，說明樣品中的防腐劑對添加的微生物只是起到一定的抑制作用，并不能有效殺滅，當樣品的防腐效能下降或添加的微生物對樣品的防腐劑出現耐藥性時，添加的微生物又開始進行繁殖。

3 結論

本研究通過微生物試驗，對化妝品的防腐體系進行了構建與優化，確認了11種防腐劑在化妝品配方中的添加比例以及防腐效果：（1）由羥苯甲酯添加0.2%，羥苯丙酯添加0.2%，苯氧乙醇添加1%，明串球菌/蘿卜根發酵產物濾液添加3%～4%，秦椒果提取物/朝鮮白頭翁提取物/須松蘿提取物添加1%分別構建的化妝品防腐體系防腐效果為優良；（2）由苯氧乙醇添加0.8%，咪唑烷基脲添加0.6%，明串球菌/蘿卜根發酵產物濾液添加2%，秦椒果提取物/朝鮮白頭翁提取物/須松蘿提取物添加0.6%，辛酰羥肟酸/己二醇/辛甘醇添加1.5%，辛酰羥肟酸/戊二醇/辛甘醇添加1.5%分別構建的化妝品防腐體系防腐效果為勉強通過，需要重新調整；（3）由羥苯丙酯添加0.1%，咪唑烷基脲添加0.2%，明串球菌/蘿卜根發酵產物濾液添加1%，秦椒果提取物/朝鮮白頭翁提取物/須松蘿提取物添加0.4%，對羥基苯乙酮/辛甘醇添加0.6%，己二醇/辛甘醇添加0.6%分別構建的化妝品防腐體系防腐效果為無效，需要重新調整。通過化妝品微生物試驗的測試，可以為化妝品配方中防腐劑防腐效果提供有效的數據參考。

表2 （混合）細菌一次加菌28 d微生物試驗結果

表3 （混合）霉菌一次加菌28 d微生物試驗結果