支原體肉湯培養基的優化及效果評價

張博，馬樂，薄曉菲，王雨，孫遠，牛明春

（北京生物制品研究所有限責任公司，北京 100176）

支原體是生物制品細胞培養生產工藝中常見的污染物，2015年版《中華人民共和國藥典》推薦使用支原體肉湯培養基檢測肺炎支原體，精氨酸支原體培養基檢測口腔支原體[1]。市場上檢測肺炎、口腔支原體也是分別使用這兩種培養基。本研究對支原體肉湯培養基在藥典配方的基礎上進行了配方優化后，可以替代市場上藥典配方生產的支原體肉湯和精氨酸支原體肉湯培養基，用于同時檢測肺炎、口腔支原體，從而達到用途及培養、檢定的統一性，便于生產、研究等工作。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肺炎支原體（MP），990420，首都兒科研究所；口腔支原體（MO），ATCC23714，購自美國ATCC；精氨酸支原體肉湯培養基、肺炎支原體肉湯培養基，北京三藥科技開發公司生產。

pH儀雷磁pHS-3D型，上海三信。

1.2 配制培養基

1號培養基：配方優化后的新鮮支原體肉湯培養基，成分為硫酸鎂、氯化鎂、牛肉浸粉、酵母浸粉、氯化鈉、葡萄糖、L-精氨酸、酚紅和精氨酸鹽酸鹽。2號培養基：配方優化后的干粉支原體肉湯培養基，配方同1號培養基。3號培養基：精氨酸支原體肉湯培養基配方同藥典。4號培養基：肺炎支原體肉湯培養基配方同藥典。其中，1、2、3號培養基接種口腔支原體，1、2、4號培養基接種肺炎支原體。

1.3 培養基合格性鑒定

4種培養基經高壓滅菌后[2]第0 d、7 d、14 d、21 d和28 d，觀察外觀、檢測pH值，每種培養基設4個重復；在20～25 ℃和30～35 ℃兩個溫度下對4種培養基進行無菌性檢查。

1.4 適用性檢查

1.4.1 菌種的復蘇

將“1.1”中的菌種轉種到支原體培養基中，（36±1）℃培養2～3 d觀察復蘇情況或可繼續復蘇一代。

1.4.2 工作菌株制備

將復蘇的參考菌株轉種于支原體培養基中（36±1）℃培養 2～3 d。

1.4.3 菌懸液制備

將“1.4.2”中工作菌株用支原體培養基稀釋，肺炎支原體稀釋到10-7～10-9，口腔支原體稀釋到10-3～10-5，分別接種于4種培養基中。平行試驗3次，每次接種中管各4支。接種之前4種支原體培養基中應按20%的比例加入馬血清。

1.4.4 培養觀察

（36±1）℃培養7～14 d，觀察培養基顏色變化（變紅或變黃）及變色管數，以判定該培養基的變色單位。支原體培養基變色單位應達到[1]：肺炎支原體10-8、口腔支原體 10-4。

2 結果與分析

2.1 外觀檢查

如圖1所示，4種培養基在滅菌后0～28 d外觀澄清透明，1號培養基較比其他3種培養基顏色深。

2.2 pH值監測

1、2、4號培養基合格pH值為7.4～7.8，3號培養基合格pH值為6.9～7.3。如表1所示，第0 d、7 d、14 d、21 d和28 d，4種培養基在滅菌后pH值全部在合格范圍內。

表1 4種培養基pH值變化情況

2.3 無菌性檢查

4種培養基在20～25 ℃和30～35 ℃下培養28 d均無雜菌生長。

2.4 適用性檢查

2.4.1 口腔菌株接種結果

表2為口腔菌株的接種結果。用統計學方法進行數據處理，發現在規定的檢定周期內，口腔菌液3個稀釋度接種的優化培養基（1號、2號）與藥典配方精氨酸支原體肉湯培養基（3號）陽性管數差異無顯著意義（χ2=0，P=1.000 0）[3]。

表2 口腔菌株接種結果

接種口腔支原體菌液的3號、2號、1號培養基陽性靈敏度變色有差異。在第3 d時，稀釋度為10-3的1號、2號培養基已肉眼可見有顏色變化，但無法用影像顯現；第4 d，1號、2號培養基已明顯優于3號培養基，且3次平行試驗結果完全一致。

圖1 培養基外觀檢查

2.4.2 肺炎菌株接種結果

表3為肺炎菌株的接種結果。用統計學方法進行數據處理，發現在規定的檢定周期內，肺炎菌液3個稀釋度接種的優化配方培養基（1號、2號）與藥典配方支原體肉湯培養基（4號）陽性管數差異無顯著意義（χ2=0，P=1.000 0）[3]。代藥典配方并應用于口腔支原體和肺炎支原體的同時檢測。

表3 肺炎菌株接種結果

圖2 肺炎菌株接種實物圖

如圖2所示，為肺炎菌株接種圖，接種肺炎支原體菌液的1號、2號、4號培養基靈敏度無顯著差異。

3 結論

優化配方制備的支原體肉湯培養基從質控項目到使用效果與藥典配方制備的肺炎支原體肉湯培養基、精氨酸支原體肉湯培養基結果無差異，可完全替