HPLC法測定清咽丸中靛藍的含量

馮娟，郭均怡，覃亮*

（1.廣東食品藥品職業學院，廣東廣州 510520；2.肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶 526061）

清咽丸主治功能為清熱利咽、生津止渴，常用于肺胃熱盛所致的咽喉腫痛、聲音沙啞、口舌干燥、咽下不利等癥狀，緩解咽部不適。青黛作為清咽丸的成分之一，其性咸、寒，無毒，入肝、肺、胃經，具有清熱涼血、解毒消斑、清肝去火、定驚等功效[1]。在醫學研究方面，研究發現青黛含有靛藍、靛玉紅、青黛酮、β-谷甾醇、色胺酮等有效成分[2-5]，其中靛藍是一種衍生自前體物吲哚的芳香族化合物，在天然植物中提取出來的植物靛藍具有清熱解毒、消斑、止血、抗炎、抗衰老、抗疲勞、抗癌、保肝等作用[6]。雖然青黛在清咽丸中起著清熱解毒、緩解肝火所致的咽喉腫痛的重要作用，但在藥典以及其他文獻均沒有關于青黛在清咽丸中的定量指標，本研究根據《中國藥典》2015版一部和對中成藥中靛藍進行含量測定的相關文獻[7]，對清咽丸中的靛藍進行含量測定方法探究和驗證，以更好地控制產品質量，保證發揮藥品主要功效。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

LC-20A高效液相色譜儀，島津企業管理（中國）有限公司；XS205DU電子天平（十萬分之一），METTLER TOLEDO公司；KO-500E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UPR-IV-20T優普系列超純水機，四川優普超純科技有限公司；UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司。

1.2 試劑

清咽丸（大蜜丸）購于北京同仁堂科技發展股份有限公司制藥廠，批號17010634、17013112、16022745；靛藍對照品購于中國食品藥品檢定研究院；高效液相色譜儀所用乙腈為色譜純，廣州化學試劑廠；N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙酸乙酯、氯仿均為分析純，廣州化學試劑廠，所用水為超純水。

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液的制備

用電子天平精密稱取靛藍對照品2.51 mg置于50 mL棕色容量瓶中，加入適量N,N-二甲基甲酰胺超聲使靛藍對照品完全溶解，待冷卻至室溫后加入N,N-二甲基甲酰胺稀釋定容至刻度線，搖勻即得濃度為50.2 μg/mL的靛藍對照品母液。從母液中精密吸取4 mL置于10 mL容量瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺稀釋定容至刻度線，即得濃度為20.1 μg/mL的靛藍對照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備

取清咽丸（批號17010634）足量，剪碎并混勻，精密稱取適量剪碎的藥品于銅盅，同時精密稱取相同質量的硅藻土置于銅盅，研勻至細密均一、顏色一致、無大顆粒狀態，即為樣品。精密稱取3 g樣品于100 mL帶塞錐形瓶中，加入25 mL N,N-二甲基甲酰胺，精密稱定整體質量，避光，超聲30 min，取出并冷卻至室溫后精密稱定質量，加入N,N-二甲基甲酰胺補足失重，搖勻，取粗濾液適量，用0.45 μm濾頭濾過，取適量濾液作為供試品溶液。

1.3.3 陰性溶液的制備

按照清咽丸處方進行藥材配比，除青黛之外的其他八味藥材，粉碎成細粉，過5號網篩（80目）混勻備用。按照1.3.2項下的方法，制成缺少青黛的陰性樣品溶液，用0.45 μm濾頭濾過，取適量濾液作為供試品陰性溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μL），以十八硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相為乙腈∶水=42∶58，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，泵壓≤25 MPa，定量方法為外標法，進樣量10 μL，檢測波長286 nm，理論塔板數按靛藍峰計算應不低于3 000。

2 結果與分析

2.1 專屬性考察

吸取清咽丸供試品溶液、靛藍對照品溶液以及陰性樣品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，確定清咽丸除青黛這個藥材含有靛藍外無其他藥材成分干擾（圖1），故該法可以進行清咽丸中靛藍含量的測定。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 線性關系考察

配制濃度為 12.6 μg/mL、15.1 μg/mL、20.1 μg/mL、25.1 μg/mL、30.1 μg/mL、50.2 μg/mL的靛藍對照品溶液，分別吸取10 μL溶液注入液相色譜儀，在“1.4”色譜條件下進行檢測，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制出靛藍對照品的標準曲線得到回歸方程Y=54 687X-41 567，R2=0.9998，圖2表明靛藍在12.6～50.2 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

圖2 不同濃度靛藍的出峰線性關系圖

2.3 精密度試驗

取濃度為20.1 μg/mL的靛藍對照品溶液在“1.4”色譜條件下連續進樣6次。2015版中國藥典規定，含量測定方法學驗證中，精密度試驗的相對標準偏差RSD需在3%范圍內。本次實驗結果顯示，連續進樣6次的峰面積大小相近，峰面積分別為1 050 872、1 050 550、1 050 695、1 050 350、1 050 959、1 050 540，RSD=0.12%，說明方法精密度良好。

2.4 穩定性試驗

精密量取供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h按照“1.4”色譜條件進行靛藍含量測定。結果顯示，不同時間段檢測靛藍的峰面積 為 1 108 006、1 106 491、1 105 664、1 104 983、1 104 532、1 103 074、1 098 996、1 098 600，平均值為1 103 791，RSD=0.31%（n=8），說明本品制備后24 h內穩定。

2.5 重復性試驗

在“1.3.2”條件下制備6組重復性供試品溶液，按照“1.4”色譜條件進行靛藍含量測定。從實驗結果可知，清咽丸中靛藍的含量分別為2.019 1 mg/丸、2.000 7 mg/丸、2.005 7 mg/丸、2.010 2 mg/丸、2.018 4 mg/丸、2.002 9 mg/丸，平均值為2.009 5 mg/丸，RSD=0.78%，相對標準偏差較小，在藥典規定含量測定方法學驗證中關于重復性試驗相對標準偏差不大于3%的范圍內，說明此方法重現性良好。

2.6 加樣回收試驗

取6份供試品進行加樣回收率試驗。對照品的加入量與樣品中靛藍含量之和在標準曲線的線性范圍內，結果顯示同一批次的6份供試品溶液檢測得到的靛藍回收率分別為99.23%、98.89%、99.14%、99.49%、100.11%、100.13%，平均回收率為99.50%，RSD=0.52%，所測得的回收率結果均在藥典規定范圍內，表明此含量測定方法可行。

2.7 供試品含量測定

取3個不同批次的供試品按照“1.3.2”制成供試品溶液，在“1.4”色譜條件下進行含量測定。如表1所示，3個不同批次的清咽丸中靛藍含量稍微不同，但其RSD均較小，說明此測定方法穩定且可行性高。

表1 3組不同批號清咽丸中靛藍的含量

3 結論

通過實驗，確立了利用高效液相測定清咽丸中靛藍含量的方法，此方法高效便捷，可以快速有效地檢測出清咽丸中靛藍的含量，方法精密性、穩定性、重現性均良好，證明本實驗方法可有效地監測清咽丸的質量。