綠茶多酚在新藥設計中的應用研究

徐斯盛，郭抗蕭，臧婧蕾，周羽

（長沙衛生職業學院，湖南長沙 410001）

有關數據表明，經常喝茶可以有效預防VEGF導致的角膜血管的產生[1]，茶葉中的綠茶多酚進入體內有效阻止了皮細胞的進一步增生，致使小血管的數目與長度顯著降低。但綠茶多酚在設計相應的抑制藥物等領域仍沒有邁出具有突破性的一步。所以，把綠茶多酚運用于抑制性新藥物的設計中實際意義重大。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶多酚中兒茶素類化合物的主要成分，本研究利用其抑制特性以及潛在的抗癌性對綠茶多酚作進一步研究，以期找到有效抑制癌細胞增殖的化合藥物。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

肝癌細胞株HepG2，湖南豐暉生物科技有限公司產品。HepG2細胞株適應于青霉素與鏈霉素皆為100 U/mL的RPMI1640培養基中，培養箱環境為：溫度37 ℃、濕度充足、CO2含量5%。茶鮮葉，長沙普韻茶葉有限公司產品。

1.2 試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（PBS），長沙中天生物技術開發有限公司；RPMI1640培養基，杭州吉諾公司；胰酶、兒茶酚氧位甲基轉移酶、硫酸基轉移酶（SULT）、PAPS硫酸基供體、葡萄糖醛酸轉移酶，湖南天合生物公司產品；噻唑藍（MTT），Sigma；DAPI試劑，長沙維世爾公司；AnnexinV—F1TC試劑盒，上海市臥宏公司；二甲基亞砜（DMSO），上海艾銳化工有限公司。

3H24RI臺式智能高速離心機，長沙東旺實驗儀器有限公司；DM6 B熒光顯微鏡，德國徠卡；LSRII流式細胞檢測儀，長沙科文生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 材料預處理

茶鮮葉充分曬干，抑制多酚氧化酶活性，保留30%的綠茶多酚，在20 ℃環境下稱取磨碎茶樣2 g，用300 mL超純水煮沸，50 min后靜置冷卻再過濾，濾液用PBS制備成10 g/L濃度的溶液，再次過濾殺菌后避光低溫貯存，用前稀釋至指定濃度。用PBS配制濃度為5 g/L的MTT溶液，過濾殺菌后低溫貯存待用。

1.3.2 肝癌HepG2細胞培養

在15%小牛血清的RPMI1640培養基中進行細胞培養，并以濃度為0.15%的胰酶消化。用臺盼藍染色法統計細胞數量，2.0×104個/cm2接種傳代，直至細胞濃度為80%時即可用于試驗，試驗前用胰酶消化。

1.3.3 EGCG的甲基化、葡萄糖醛酸化及硫酸化

兒茶酚氧位甲基轉移酶可實現兒茶素進一步甲基化，SULT將PAPS硫酸基供體轉至醇、胺類的受體分子中，實現EGCG的硫酸化；葡萄糖醛酸轉移酶將綠茶多酚轉化為Ⅱ相代謝化合物質，完成EGCG的葡萄糖醛酸化[2]。因此，綠茶多酚中的EGCG經由甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸化后得到的代謝化合物質，能有效抗衰老和抑制癌細胞的活性與增殖，其過程如圖1所示。EGCG甲基化、葡萄糖醛酸化及硫酸化后，對細胞具備一定的抑制作用，為癌癥的防治帶來了不錯的效果，但綠茶多酚的代謝及化合反應也產生了代謝不穩定、藥效時間短和藥物成分利用率不高的問題。這就需要借助基于藥理學機制的藥物制備策略來彌補這些缺陷[3]。

1.4 MTT實驗分析EGCG合成藥物的抑制作用

借助胰酶消化肝癌HepG2細胞，制成濃度為50個/mL的單細胞懸液，放進圓底96孔的細胞培養模板中，每孔0.2 mL。（1）不同劑量的EGCG合成藥物對肝癌HepG2細胞的抑制作用：肝癌HepG2細胞暴露培養的時間為48 h，RPMI1640培養基中EGCG合成藥物劑量為25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L；（2）EGCG合成藥物暴露時間對肝癌HepG2細胞的抑制作用：使用EGCG合成藥物劑量為100 mg/L的RPMI1640培養基，暴露培養肝癌HepG2細胞12 h、24 h、48 h及72 h。在實驗結束前4 h，每個孔分別加入MTT液10 mL，再培養4 h，去掉上清液，每孔放入DMSO 150 μL，避光振蕩5 min，計算各組的肝癌HepG2細胞存活率。

1.5 驗證方法

1.5.1 DAPI染色法

圖1 EGCG的甲基化、葡萄糖醛酸化及硫酸化過程

把培養好的HepG2細胞用PBS清洗幾次，加入250 mL基于PBS制備的3 mg/L的DAPI，室溫中培養0.5 h后，在熒光顯微鏡下觀察EGCG合成藥物誘導HepG2細胞凋亡時細胞核的形態變化。

1.5.2 AnnexinV-FITC檢測法

把收集的HepG2細胞再培養48 h，做離心處理后用PBS清洗幾次，加入1O mL AnnexinV—FITC試劑，搖勻避光室溫靜置0.5 h，再用流式細胞儀分析檢測肝癌HepG2細胞的凋亡率。

2 結果與分析

2.1 基于DAPI染色法的觀察結果與分析

用EGCG合成藥物（100 mg/L）處理的HepG2細胞進行DAPI染色后，通過熒光顯微鏡觀察到正常細胞的細胞核形態為染色質均勻分布、核膜等結構完整、細胞核整體呈藍色；而凋亡細胞的細胞核雖然也為藍色，但染色質表現出極大程度的波折濃縮、凝聚邊緣化形態，出現了凋亡小體以及細胞核碎塊（如圖2所示），證明EGCG合成藥物可以誘發HepG2細胞的凋亡。

圖2 凋亡細胞的細胞核染色質形態變化過程

2.2 基于AnnexinV—FITC檢測法的觀察結果與分析

如圖3所示，劑量不同的EGCG合成藥物作用于肝癌HepG2細胞48 h后，隨著EGCG合成藥物濃度的增大，細胞存活率逐漸下降，呈現出顯著的劑量依賴關系。

如圖4所示，100 mg/L EGCG合成藥物分別作用于肝癌HepG2細胞12 h、24 h、48 h、72 h后，各處理組的細胞數目變化程度存在差異，反映出顯著的時間依賴關系，且暴露時間越長，細胞存活率越低。

圖3 不同劑量EGCG合成藥物對細胞的抑制

圖4 EGCG合成藥物不同暴露時間對細胞的抑制

3 結論

EGCG合成藥物對肝癌HepG2細胞活性及增殖具有顯著抑制作用，并受到藥物劑量與作用時間的影響。DAPI染色法與AnnexinV—FITC驗證表明，EGCG合成藥物可以誘發HepG2細胞的凋亡，且在一定限度內細胞凋亡率與藥物劑量、作用時間存在正相關關系。綜上所述，綠茶多酚在臨床治療藥物運用過程中，對時間與劑量依賴程度較大，還有待進一步研究其用量以及藥物學原理。