直接化學(xué)發(fā)光免疫分析法定量檢測鱗狀細(xì)胞癌抗原SCC-Ag試劑研究

陳珠金

[安邦（廈門）生物科技有限公司，福建廈門 361000]

鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCC-Ag）是一種分子量為48 000的糖蛋白，是從子宮頸鱗狀細(xì)胞組織中分離出來的，屬于腫瘤相關(guān)抗原TA-4的亞段，存在于鱗狀細(xì)胞癌的胞漿內(nèi)，是一種特異性很好并最早用于診斷鱗癌的腫瘤標(biāo)志物。SCC-Ag最初從宮頸癌組織中分離獲得，就生物活性而言屬絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，包括SCC 1和SCC 2兩個(gè)基因。SCC-Ag廣泛存在于不同器官的正常組織中（含量極微）和惡性病變的上皮細(xì)胞中，在血清中至少有4種形式的SCCAg：游離SCC1、游離SCC2以及與之相對應(yīng)的絲氨酸蛋白酶結(jié)合物。SCC-Ag在正常的鱗狀上皮細(xì)胞中抑制細(xì)胞凋亡和參與鱗狀上皮層的分化，在腫瘤細(xì)胞中參與腫瘤的生長，有助于所有鱗狀上皮細(xì)胞起源癌的診斷和監(jiān)測，如子宮頸癌、肺癌（非小細(xì)胞肺癌）、頭頸部癌、食管癌以及外陰部鱗狀細(xì)胞癌等[1]。

血清鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCC-Ag）的常用測定方法有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析、免疫比色法和化學(xué)發(fā)光法，其中化學(xué)發(fā)光法檢測SCC-Ag能做到定量檢測，其量值水平高低與腫瘤的進(jìn)展程度相關(guān)，可作為愈后及提示復(fù)發(fā)的指標(biāo)[2]。本文研制的試劑以羧基修飾的磁性微球偶聯(lián)SCC-抗體1（SCC-Ab1），利用吖啶磺酰胺標(biāo)記SCC-抗體2（SCC Ab2），采用雙抗體夾心法，形成磁性微球偶聯(lián)SCC Ab1-SCC Ag-吖啶磺酰胺標(biāo)記SCC Ab2的復(fù)合物，在施加磁場的作用下，通過洗滌將沒有結(jié)合的游離蛋白與免疫復(fù)合物分離，復(fù)合物在激發(fā)液的作用下發(fā)光，相對發(fā)光強(qiáng)度（RLU）與樣本中的SCC-Ag濃度呈正相關(guān)，從而研制出直接化學(xué)發(fā)光免疫分析法定量檢測鱗狀細(xì)胞癌抗原SCC-Ag的試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

SCC抗體配對，上海領(lǐng)潮生物科技有限公司；SCC校準(zhǔn)品、糖類抗原CA125、CA153、CA199、CA724，血細(xì)胞角蛋白19片段Cy21-1標(biāo)準(zhǔn)品，上海領(lǐng)潮生物科技有限公司；人血清白蛋白、膽紅素、血紅素、甘油三酯、二甲基亞砜（DMSO）、賴氨酸，Sigma-Aldrich公司；甲胎蛋白AFP，雙流正龍生化制品研究室；癌胚抗原CEA，廈門光免生物技術(shù)有限公司；磁性微球（羧基，2.9 μm），日本JSR株式會社；吖啶磺酰胺（NSP-SA-NHS），深圳市美凱特科技有限公司；脫鹽柱，Thermo fisher公司；牛血清白蛋白BSA，德國Merck公司；碳化二亞胺（EDC）、嗎啉乙磺酸（MES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），Sigma-Aldrich公司；TBST緩沖液、PBST緩沖液、CB緩沖液，北京譜析科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SMART 6500全自動化學(xué)發(fā)光測定儀，科斯邁生物科技有限公司；1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜，Agilent Technologies。

1.1.3 臨床樣本

定值人血清100例，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院提供，定值結(jié)果由羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制方法

（1）磁珠儲存液配制。用pH 7.4、濃度為0.025 mol/L的TBST緩沖溶液溶解BSA至0.1%的濃度。（2）吖啶標(biāo)記抗體保存液配制。pH 6.5、濃度為0.01 mol/L PBST溶液，加入1% BSA、5%蔗糖、0.01% NaN3。（3）激發(fā)液配制。激發(fā)液A：0.1%的H2O2+0.1 mol/L的HNO3；激發(fā)液B：0.2 mol/L NaOH+1% TritonX-100。

1.2.2 磁性微球偶聯(lián)SCC-Ab1制備

取10 mg羧基修飾的磁性微球混懸液于樣品管中，加pH 5.0、濃度0.1 mol/mL MES溶液900 μL混勻，然后分別加100μL 10 mg/mL EDC溶液和200 μL 10 mg/mL NHS溶液，室溫反應(yīng)30 min，活化磁性微球；去上清，磁珠重新混懸液于1 mL MES溶液（pH 5.0、濃度0.1 mol/mL）；隨后直接加入SCC-Ab1 100 μg，37 ℃孵育3 h；去上清，加入磁珠儲存液1 000 μL，室溫封閉1 h后，用0.025 mol/mL TBST緩沖液洗滌4次，除去游離抗體，加入磁珠儲存液1 000 μL存放于2～8 ℃冰箱中備用，使用時(shí)用磁珠儲存液稀釋。

1.2.3 吖啶磺酰胺標(biāo)記SCC Ab2制備

取適量抗體，用50 mmol/L pH 9.2的CB稀釋至1 mg/mL，脫鹽柱純化；計(jì)算抗體的摩爾數(shù)，在純化后的抗體中加入15倍摩爾數(shù)的NSP-SA-NHS（DMSO稀釋），4 ℃避光反應(yīng)1 h；加入20倍抗體摩爾數(shù)的賴氨酸避光反應(yīng)30 min，用高效液相色譜（流動相：pH 6.5、濃度0.1 mol/L的PBS緩沖液；色譜柱：分子篩色譜柱，紫外檢測器：波長280 nm）純化標(biāo)記后的復(fù)合物，加入等體積甘油于-20 ℃下凍存，使用時(shí)用吖啶標(biāo)記抗體保存液稀釋。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)方法

20 μL待測樣本，100 μL吖啶磺酰胺標(biāo)記SCC Ab2結(jié)合物和20 μL磁性微球偶聯(lián)SCC-Ab1結(jié)合物加入樣品杯中；37 ℃條件下溫育20 min后，洗滌液清洗3次；加入激發(fā)液A 100 μL，激發(fā)液B 100 μL，檢測相對發(fā)光強(qiáng)度。全自動化學(xué)發(fā)光儀器參數(shù)按上面的步驟設(shè)置。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

在免疫反應(yīng)中，對校準(zhǔn)品或樣品采用兩個(gè)平行孔測定，取其平均值，相對發(fā)光強(qiáng)度值（RLU）和校準(zhǔn)品（或樣品）濃度進(jìn)行對數(shù)線性回歸，其回歸方程為：lg(Y)=A+Blg(X)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑配對工作抗體濃度的選擇

磁性微球-SCCAb1結(jié)合物與吖啶磺酰胺-SCC Ab2結(jié)合物的用量和搭配對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響。對兩個(gè)抗體結(jié)合物的濃度進(jìn)行優(yōu)化，檢測樣本為30 ng/mL的SCC校準(zhǔn)品；按實(shí)驗(yàn)方法操作，結(jié)果顯示，對磁性微球-SCCAb1結(jié)合物分析磁珠濃度0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)變化；隨著磁珠濃度的升高，發(fā)光信號也隨之升高，直到磁珠濃度為0.5 mg/mL時(shí)，發(fā)光信號達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，因此選擇磁性微球-SCCAb1結(jié)合物磁珠濃度為0.5 mg/mL；保持結(jié)合物中磁珠濃度為0.5 mg/mL不變，隨著吖啶磺酰胺-SCC Ab2結(jié)合物的抗體濃度從0.8 μg/mL減小到0.1 μg/mL，化學(xué)發(fā)光信號都一直在降低，考慮到反應(yīng)靈敏度和試劑成本，選擇吖啶磺酰胺-SCC Ab2結(jié)合物抗體濃度為0.4 μg/mL。

2.1 線性范圍

將接近線性范圍上限標(biāo)準(zhǔn)品（200 ng/mL）的樣本用正常人血清稀釋6個(gè)濃度，其中稀釋的最小濃度1.2 ng/mL接近線性范圍下限。對每一個(gè)樣本均檢測3次，計(jì)算平均值，相對發(fā)光強(qiáng)度值作對數(shù)線性擬合曲線。如圖1所示，線性范圍（1.2～200 ng/mL）內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)R≥0.999，顯示了良好的相關(guān)性。

圖1 直接化學(xué)發(fā)光法測定SCC-Ag的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 最低檢出限

用零濃度校準(zhǔn)品作為樣本進(jìn)行檢測，重復(fù)測度20次，得出20次檢測結(jié)果的RLU值，計(jì)算其平均值（）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品和1.2 ng/mL校準(zhǔn)品之間的濃度-化學(xué)發(fā)光（RLU）值結(jié)果，進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將+2SD所對應(yīng)的RLU值帶入方程式中，求出對應(yīng)的濃度值，為0.1 ng/mL，即為最低檢出限。

2.3 精密性

批內(nèi)精密性，用10 ng/mL、100 ng/mL 2個(gè)濃度SCC-校準(zhǔn)品，每個(gè)濃度平行檢測10次，分別求其x—和SD，根據(jù)公式（1）求得批內(nèi)變異系數(shù)（CV）≤5%。批間精密性，制備3批試劑，同時(shí)測定濃度10 ng/mL、100 ng/mL 2個(gè)濃度SCC校準(zhǔn)品，每個(gè)批次檢測10次，計(jì)算30次結(jié)果的x—和SD，根據(jù)公式（1）求得批間變異系數(shù)（CV）≤10%。

2.4 回收率

將濃度為30 ng/mL、100 ng/mL的SCC校準(zhǔn)品中加入3份正常人血清樣品（內(nèi)源性檢測濃度均低于1.0 ng/mL）中，所加入SCC校準(zhǔn)品與血清之間體積比為1∶9，測定的回收率在90.1%～106.7%范圍內(nèi)，平均回收率98.7%。

2.5 穩(wěn)定性

將全套試劑37 ℃放置6 d，檢測標(biāo)準(zhǔn)品，相對發(fā)光強(qiáng)度與放置前對比，確定熱穩(wěn)定性的變化幅度≤10%；全套試劑按試劑儲存條件（2～8 ℃）下放置1年，檢測標(biāo)準(zhǔn)品，相對發(fā)光強(qiáng)度與放置前對比，確定長期穩(wěn)定性的變化幅度≤15%。

2.6 比對試驗(yàn)

檢測福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院提供的合理分布在線性區(qū)間內(nèi)不同濃度100例臨床標(biāo)本，并與羅氏電化學(xué)發(fā)光SCC-Ag測定結(jié)果對比。如圖2所示，回歸方程為y=1.035x-0.199，相關(guān)系數(shù)R2=0.989 4，表明兩者測試血清中SCC-Ag的含量具有良好的相關(guān)性。

圖2 本研究試劑盒檢測結(jié)果與羅氏電化學(xué)試劑測定結(jié)果比對

2.7 特異性

如表1所示，通過與常見的干擾因素人血清白蛋白、甘油三酯、血紅素、膽紅素，常見腫瘤標(biāo)志物 AFP、CEA、CA125、CA153、CA199、CA724、Cy21-1進(jìn)行交叉反應(yīng)，得到測定值均小于0.1 ng/mL，表明該方法具有良好的特異性。

表1 試劑特異性分析

SCC-Ag是腫瘤相關(guān)抗原TA-4的亞型，Kato和Torigoe于1977年首次描述了該抗原[3]。早期研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者血清TA-4水平高于正常對照組水平[4]；SCC-Ag由鱗狀上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是檢測鱗癌較好的標(biāo)志物，該物質(zhì)最早發(fā)現(xiàn)于宮頸鱗癌中，后來逐漸在食管、咽和肺癌中發(fā)現(xiàn)。血清SCC-Ag水平不僅可以反映鱗狀上皮細(xì)胞癌患者的病變程度，還有助于判斷患者的預(yù)后、監(jiān)測疾病復(fù)發(fā)及療效。隨著化學(xué)發(fā)光法的日益推廣，SCC-Ag的臨床應(yīng)用日漸受到重視。

化學(xué)發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immuno-Assay，CLIA）是在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析技術(shù)，可以根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光強(qiáng)度來確定物質(zhì)的含量，該方法在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床檢測中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[5]。本文研究采用的發(fā)光劑是吖啶磺酰胺，它不需要催化劑、只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能直接發(fā)光，反應(yīng)迅速、背景低、信比高；磁性微球具有良好的生物相容性，在免疫分析中經(jīng)常被作為固相載體負(fù)載抗體抗原。在磁場的作用下，磁性分離簡化了測定過程中所需要的洗滌、分離操作，使檢測更簡便、快速，可以實(shí)現(xiàn)微量樣品的有效分離。

3 結(jié)論

本研究成功研制出定量測定人血清中SCC-Ag的直接化學(xué)發(fā)光分析試劑，具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定好、線性范圍廣等特點(diǎn)，并且將該試劑應(yīng)用于臨床人血清中SCC-Ag的測定，與臨床分析界公認(rèn)的羅氏全自動電化學(xué)發(fā)光儀的測定值進(jìn)行了對比，顯示相關(guān)性很好。因此，本試劑具備良好的臨床應(yīng)用前景。