程序性細胞壞死與中樞神經系統疾病研究進展

李 佳,趙又誼,趙秋影,莫輝明,岳屹立

(1.延安大學醫學院病理生理學教研室，陜西 延安 716000；2.空軍軍醫大學神經生物學教研室，陜西 西安 710032；3.延安大學醫學院生理學教研室，陜西 延安 716000)

中樞神經系統疾病是由于各種因素導致腦與脊髓結構或功能損傷，從而引起的一系列疾病，因神經元損傷的不可逆性，探究其損傷機制也是當下研究熱點。一般認為細胞死亡方式有凋亡壞死兩種，然而近來發現了一種新的細胞死亡方式，是由信號通路介導的細胞死亡，兼具壞死和凋亡的特點，故稱之為程序性壞死。

1 程序性細胞壞死(Programmed cell necrosis，PCN)及其機制

1.1 程序性細胞壞死 細胞死亡方式主要分壞死和凋亡兩種。一般認為壞死是細胞受到病理刺激后，不受控制的死亡方式，質膜破壞、細胞器腫脹、細胞內容物滲漏是其典型的形態學特征。但凋亡則是為維持內環境穩定，受基因嚴格調控、自主有序的死亡方式，與細胞壞死的被動性相比，凋亡是主動的過程，受到嚴格的基因激活、表達及調控，在細胞發育、維持穩態及發病機制中起到重要作用，其顯著特征包括核固縮、裂碎、分解，膜泡化形成凋亡小體。然而最近研究發現還存在一種活躍的、有多種因子參與的、受到嚴格調控的細胞壞死，稱之為PCN[1]。這種壞死方式的胞漿和胞膜具有典型的壞死樣形態，研究發現誘導程序性細胞壞死的過程涉及到很多細胞因子 [如腫瘤壞死因子(TNF)、Fas配體、TNF-α凋亡因子、雙鏈RNA、γ干擾素等]的參與。與細胞凋亡時激活Caspase-3相比，程序性壞死的發生不依賴于Caspase-3的激活，具有其獨特特征[2]。

程序性細胞壞死會引發很多病理過程，如心、腎、腦缺血再灌注損傷[3]，以及病原體性或損傷性炎癥疾病等[4]。因此，該壞死通路很可能成為預防細胞死亡的潛在靶點。在大鼠[5]、豚鼠[6]離體心臟缺血再灌注模型中用necrostatin-1或necrostatin-5等程序性壞死抑制劑干預后，發現均起到了心臟保護的作用。在很多中樞神經系統疾病中，程序性細胞壞死也起到了至關重要的作用。Degterev等[7]報道稱程序性壞死介導24(S)-hydroxycholesterol誘發的神經元死亡。動物實驗中necrostatin-1可延遲小鼠腦缺血性損傷[8]。小鼠模型內注射necrostatin-1，對腦出血(ICH)繼發的神經血管損傷也具有保護作用[9]。上述研究表明程序性壞死在防治中樞神經系統疾病中很有可能起到重要作用，因此了解其信號機制具有重要臨床意義。

1.2 程序性細胞壞死的介導 程序性壞死是壞死的一種，啟動由其死亡受體及其配基實現、隨后通過死亡受體完成介導。Fas、TNF-receptor 1(TNFR1)、TNFR2、TRAIL receptor 1(TRAILR1) 以及TRAILR2等死亡受體不僅是凋亡信號的起始，也在激活程序性壞死中發揮重要作用。

TNF-α是最為重要的程序性壞死誘導物之一。TNF-α可以通過TNFR1胞外部分Cys-rich domain 1區域組裝的前配體激活TNFR1。激活后形成的三聚體，可以在其胞內區募集到各種蛋白，如與TNFR相關的死亡結構域(TRADD)，激酶受體相互作用蛋白1(RIP1)，胞內凋亡抑制因子1(cIAP1)，cIAP2，TNFR相關因子2(TRAF2)和TRAF5等，募集后形成復合體Ⅰ，內化后其中的RIP1去泛素化與其他分子結合形成復合體Ⅱ，該復合體構成誘發凋亡或程序性壞死的核心組分。

RIPs是絲/蘇氨酸蛋白激酶家族中的一員，有啟動、調控細胞應激的作用，參與調控凋亡、壞死或存活。其中不論是凋亡還是程序性細胞壞死，RIP1均有調節作用。cIAP介導的RIP1泛素化可在死亡復合體形成及活化階段阻礙RIP1發揮作用，進而減少Caspase-8的激活。用Pan-caspase抑制劑阻斷細胞凋亡時， Fas配體和TNF-α等死亡信號可觸發程序性壞死通路以作為細胞死亡的替代方式。RIP1激酶變構抑制劑(Necrostatin-1)可以改變RIP1激酶結構，對由死亡受體通路引發的，依賴于Caspase的程序性壞死有特異性阻止作用，所以在程序性壞死信號的啟動中RIP1活性也是不可或缺的一部分。除RIP1外，RIP3激酶活性也與非Caspase依賴的死亡模式有關。Christofferson等[10]用基因工程小鼠表達出失活的RIP3激酶后，動物的所有程序性細胞壞死均被阻斷。以上發現均提示RIP激酶在程序性細胞壞死中具有調節作用。

RIP1是一個74 kDa的蛋白，氨基端含有一個絲/蘇氨酸激酶結構域(KD)，羧基端含有一個死亡結構域(DD)，N端有與RIP相同類型相互作用基序(RHIM)的中間結構域，該結構域可以與RIP3中的RHIM和一個羧基端DD結構區結合。RIP1羥基端結構域可以調節RIP1與Fas以及其他DD-containing蛋白的相互作用。RIP1是死亡誘導信號復合體(DISC)的關鍵組成部分，對細胞命運的決定起到了重要作用。除RIP1外，其同源激酶RIP3也具有觸發程序性壞死的功能。在小鼠巨細胞病毒感染的相關研究中找到了細胞存在RIP3依賴而與RIP1無關的程序性壞死的證據[11]。RIP1可以被Lys63-去泛素化蛋白酶(CYLD)去泛素化然后同TRADD、FAS-相關死亡結構蛋白(FADD)、Caspase-8形成復合體，即DISC。DISC中Caspase-8的活化是Caspase凋亡級聯反應發生的源頭，基因修飾或藥物干預將Caspase-8活性抑制，RIP1-RIP3復合體會激活程序性壞死信號。目前尚不清楚FADD和TRADD是否也是程序性壞死信號復合物或壞死小體(Necrosome)組裝所必需的蛋白。

RIP3在壞死的發生中也發揮關鍵作用。研究顯示，RIP3和RIP1通過RHIM而相互作用促進壞死小體裝配完成[12]。RIP1(IQIG)或RIP3(VQVG)的核心殘基RHIM突變會破壞細胞壞死小體的形成和程序性壞死，RIP激酶活性和壞死細胞重組可能以前饋的方式放大信號。混合譜系激酶結構域樣假激酶(MLKL)是RIP3依賴性壞死的中介物，RIP3可以在其蘇氨酸357和絲氨酸358殘基上將MLKL磷酸化，這些磷酸化的發生對壞死有至關重要的作用。敲除MLKL后具有抑制壞死的作用。缺乏MLKL的細胞對TNF-α誘導的壞死有抵抗力，也證明了MLKL在TNFα誘導的壞死中發揮關鍵作用。在結構上，MLKL擁有激酶結構域，但卻并無真正激酶的活性。MLKL偽活性位點的突變導致的壞死本質是與RIPK3無關的，MLKL修飾在RIPK3下游壞死通路也起到重要作用。

同其他E3泛素連接酶一樣，Lys63連接的RIP1會在cIAP的催化下使聚泛素基團增加，然后提供三個靶點，轉化生長因子β激酶1(TAK1)可在此結合，TAK1結合蛋白2(TAB2)，與TAB3構成TAK1-TAB2-TAB3復合體，激活核轉錄因子-κB(NF-κB)，同時反式激活如細胞FLICE類抑制蛋白(c-FLIP)等細胞保護基因。若將TAK1敲除則會導致細胞發生程序性壞死傾向。然而，若長時間和過度激活TAK1則會引發RIP3磷酸化和活化，甚至無需TNF刺激也會導致程序性壞死，但TAK1消融則會導致Caspase依賴的凋亡發生。因此，TAK1可能是凋亡和程序性壞死共同的上游調控因子。

1.3 程序性壞死過程 溶酶體膜透化(LMP)是TNF-α誘導程序性壞死的早期步驟[13]。溶酶體蛋白酶釋放到在胞漿中可能導致體內重要蛋白消化并激活其他酶類，尤其是Caspases相關蛋白。LMP可被各種不同的刺激物激活，除過ROS物質外，還有清潔功能的親溶酶體混合物、一些內細胞源性死亡蛋白等。大量LMP可導致細胞發生無Caspase激活性死亡，而且在程序性壞死中也確實發現有LMP的存在[14]。胞質磷脂酶A2(cPLA2)和神經酰胺可以在脂質過氧化的上游刺激LMP。在L929型細胞中使cPLA2過表達則抗TNF的程序性死亡會更敏感。cPLA2缺乏的L929型細胞在TNF表達后則不能積累神經酰胺，這對抗TNF誘導的程序性壞死有保護作用，也為cPLA2在神經酰胺生成和程序性壞死中起著基本作用提供了有力支持。

上述的復合體Ⅱ形成后會導致RIP3的進一步聚集與活化，隨后募集RIP3的底物分子混合系激酶區域樣蛋白(MLKL)。MLKL羧基端激酶結構域同RIP3結合，氨基端激酶結構域被磷酸化與多聚化，MLKL 通過N端插入膜結構，從細胞質轉移到細胞膜及細胞器膜上，形成通透性孔道，破壞生物膜完整性，導致大量離子內流，細胞滲透壓過高腫脹而死。

目前已確定的壞死信號下游介質中，活性氧(ROS)是程序性壞死執行中的媒介之一。TNF-α可刺激引導多種細胞產生ROS。一方面 ，ROS會阻斷呼吸鏈質子傳遞，致使細胞能量代謝障礙而死亡；另一方面，ROS可引起細胞膜脂質過氧化或改變細胞器膜某些通道蛋白功能，如溶酶體受到ROS的損傷后，溶酶體膜通透化(LMP)釋放大量溶酶體酶，細胞因此自我消化而亡。端激酶(JNK)通路信號，使用叔丁基羥基茴香醚(BHA)等抗氧化劑治療可以減少ROS水平，并在一些細胞型中有抑制死亡的作用。

在凋亡過程中，基因翻譯、蛋白酶體介導的蛋白質降解等ATP消耗過程被Caspases迅速關閉。然而這些過程在TNF誘導的程序性壞死中卻會持續，因此胞內ATP的濃度降低。多聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)作為核酶的一種，主要在DNA修復和轉錄調控中發揮重要作用，過度活化會使ATP耗盡。PARP1參與了纖維肉瘤L929型細胞TNF途徑的程序性壞死[15]。其中凋亡誘導因子(AIF)會在PARP1活化后促進下，從線粒體膜間隙向細胞核發生易位，核內有大量的Caspase無關DNA片段。藥物和基因抑制PARP1或阻斷AIF表達則會有保護細胞免受程序性壞死刺激的作用[16]。腺嘌呤核苷酸轉移酶(ANT)和親環素D(CypD)都參加了線粒體通透性轉換的過程，據此推測他們也參與了程序性壞死的過程。CypD消融可通過抑制ATP消耗而保護小鼠避免缺血性腎損傷。研究顯示ANT與CypD和電壓依賴的陰離子通道(VDAC)相互作用，形成滲透過渡孔復合物(PTPC)[17]。抑制PTPC主要成分形成的藥物和基因有VDAC，ANT和CYPD，他們在體內外均通過對抗損傷發揮細胞保護作用。這些結果提示線粒體在程序性壞死中也發揮了重要作用。

1.4 程序性壞死的保護 目前已研發出多種程序性壞死抑制物，如RIP1抑制劑、RIP3抑制劑、MLKL抑制劑等。其中RIP1激酶變構抑制劑(Necrostatin-1)，可特異性抑制RIP1激酶的活性，阻滯對RIP3的募集及兩者之間的相互作用。Chen等[18]在MLKL敲除的HT-29細胞中引入帶HA標簽的MLKL，發現會有內吞MLKL并于溶酶體結合的現象，使MLKL被降解，從而使得細胞得以保護。純化MLKL定位的細胞膜脂筏結構后可得flotillin-1和flotillin-2，這兩種蛋白都與細胞內吞有關，提示針對flotillin-1，flotillin-2可研發新型的程序性壞死抑制劑。

內體分選復合物(ESCRT)-Ⅲ對于胞內運輸而言是必需的，而它維持質膜完整性對程序性細胞壞死也有一定的拮抗作用，損傷膜修復當中ESCRT-Ⅲ是不可或缺的重要成分，在實驗中誘發MLKL寡聚化同時介導程序性壞死， MLKL激活后的定位恰好位于膜損害之處，在此募集ESCRT-Ⅲ成分，隨后將破碎的膜泡主動脫落，以此完成保護程序性細胞壞死[19]。

1.5 其他激活途徑 程序性壞死的經典途徑是激活TNF，然而細胞表面Toll樣受體(Toll-like receptor 1,TLR)及其相應配體，也可以誘發壞死復合體合成，導致細胞程序性壞死。細胞在應激、損傷、感染狀態下，TLRs會被病原相關分子觸發，若抑制Caspase活性，則脂多糖(LPS)會激活TLR3或TLR4，隨后TLR的TIR適配域感受IFN-beta(TRIF)收到相應信號，TRIF包含RHIM結構域，可與RIP1、RIP3結合而誘導壞死，這是一條主要依賴于RIP3激酶的壞死通路。Thapa等[20]在小膠質細胞中也證實了TLR信號對RIP3依賴的程序性壞死有密切聯系。

鼠胚胎成纖維細胞中的Caspase-8和FADD缺失后，Ⅰ型、Ⅱ型干擾素均能通過PKR與RIP1結合，然后產生RIP1-RIP3壞死復合體，某些細胞壞死調節可能還涉及到自分泌環路。總之，激活程序性壞死的形式絕不是單一的，但是RIP3激酶的激活，是其共同的關鍵步驟，含有RHIM結構域蛋白上游信號將RIP3活化后，使其底物MLKL磷酸化來傳遞壞死信號。

2 程序性細胞壞死與中樞神經系統疾病

2.1 創傷性腦損傷(TBI) TBI是全球死亡或者致殘的主要因素。TBI的搶救主要在于減少顱腦二次損傷，目前常用的治療技術有去骨瓣減壓術及低溫療法。大量細胞壞死是TBI致殘及死亡的重要原因之一，其中程序性壞死會引起嚴重組織損傷及功能障礙。nerostatin-1有改善小鼠皮層受控后的功能結構的作用。實驗表明哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和Akt信號通路在TBI后會被激活[21]。Akt已知是神經元細胞凋亡抑制劑，而mTOR是Akt下游效應因子。最近研究有報道Akt與mTOR聯合抑制降低海馬體海馬CA3和CA1區域的神經細胞死亡，進而改善小鼠受控皮層影響的功能結構[22]。通過TNF和zVAD(一種Caspase抑制劑)聯合誘導海馬神經細胞系HT22程序性壞死時，細胞死亡發生在PIPK1-RIPK3-pAKT組裝完成及Akt和mTOR磷酸化實現前。Akt和mTOR抑制劑預處理后阻斷線粒體ROS產生及程序性壞死的發生，提示Akt/mTOR活化通過誘導致死性氧化應激導致神經元程序性壞死。因此抑制程序性壞死有可能為TBI提供一種新的治療策略。

2.2 腦腫瘤 腦腫瘤中膠質母細胞瘤占比很重，其侵襲性和致病性都很高但預后差，治療效果不佳。其抵抗放療化療治療效果可能是由于存在細胞凋亡缺陷。Nomura等[23]發現膠質瘤細胞中紫草素會誘導依賴RIP1的程序性壞死發生。而Huang等[24]進一步發現程序性壞死和凋亡之間有密切聯系，將紫草素誘導的程序性壞死會在加入Necrostatin-1抑制劑后轉化為凋亡。日本包膜血球凝集病毒(HVJ-E)可誘導人神經母細胞瘤細胞壞死[25]，細胞胞漿中Ca2+調蛋白激酶(CaMK)Ⅱ在Ca2+濃縮時被激活，將RIP1磷酸并產生ROS。

在以5-氨基乙酰丙酸為基礎的光動力治療(5-ALA-PDT)中，將NF-kB抑制后發現程序性壞死在惡性膠質瘤細胞中也有發生[26]。研究顯示阿米洛利衍生物5-betaenzylglycinyl-amiloride會誘導膠質瘤產生程序性細胞壞死，此過程不為PARP和H2AX活化所影響[27]。此外發現AMP活化蛋白激酶(AMPK)抑制劑復合物C也有誘導腫瘤發生程序性細胞壞死的作用。以上表面程序性壞死可能會是腦腫瘤潛在的治療靶點。

2.3 腦血管疾病 腦血管疾病最常見的當屬中風，是一種大腦血供應急性障礙疾病，分缺血性和失血性。中風通常導致不可逆的神經死亡以及隨后的不良預后。中風發作后腦組織很多生化指標顯著異常，提示明顯的細胞損傷[28]。缺血性腦損傷與細胞內凋亡信號缺乏導致程序性壞死誘導產生有關[6]。程序性壞死是腦缺血、再灌注損傷中重要的死亡途徑。單獨使用程序性壞死抑制劑Necrostatin-1或將其與凋亡抑制劑(神經保護肽Gly14)humanin聯合使用發現對與氧糖剝奪后誘導的細胞死亡具有保護作用。此外，兩種抑制劑的聯合治療可以改善腦動脈堵塞及再灌注的小鼠的神經評分，減少梗死面積。敲除RIP3，或MLKL可以明顯的減輕腦缺血導致的皮質神經元死亡[29]。

程序性壞死也參與了腦出血相關的細胞死亡[9]。King等[8]在動物模型中報道了程序性壞死抑制劑Necrostatin-1可以限制細胞死亡，減少血腫體積，改善腦出血后的神經行為表現。Chang等[29]報道稱抑制劑Necrostatin-1也可以抑制凋亡和自噬通路，在腦出血小鼠模型中發揮神經保護作用。

2.4 中樞退行性疾病 中樞退行性疾病是一種較為特殊的疾病，其共同特征是結構或功能逐漸衰退，其中含有神經系統中的細胞死亡。一些最常見的神經系統疾病有肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)、阿爾茨海默癥(AD)、多發性硬化(MS)等。

ALS特征是上、下運動神經元逐漸退化,通常在確診后3～5年內由于呼吸無力死于呼吸衰竭。Bertram等[30]將人胚胎干細胞來源的運動神經元(hEs-MNs)與從ALS患者死后11 h內取得的星形膠質細胞共同培養以做建模，在此模型中也發現了ALS中存在運動神經元程序性壞死的證據。

AD是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性疾病，嚴重的神經元喪失是其主要特征，然而其細胞死亡機制尚不明確。Caccamo等[31]對AD患者尸解發現了明顯的程序性壞死特點，其程度與Braak分期、腦質量、認知分數密切相關。同時受RIPK1調控的基因組在多個獨立AD轉錄組的特征有明顯重疊。抑制AD小鼠模型中的程序性壞死后，神經元的損失明顯減少。

MS是一種炎癥性中樞神經系統疾病，腦和脊髓白質的局灶性炎性脫髓鞘和軸突變性，是多發性硬化的主要病理特征，而MS抑制少突膠質細胞死亡及促進其再髓鞘化，是MS患者永久性殘疾的重要原因之一。另外，高雪氏病(GD)是一種遺傳性代謝疾病，由于葡萄糖腦苷酶基因(GBA)突變而引起的最常見的溶酶體蓄積障礙疾病，其神經元死亡的機制一直不清，近年的研究發現RIP激酶直接參與了GD的病理過程，在 Ripk3-/-GD小鼠模型中小膠質細胞RIP3表達量與病理發展程度密切相關。

程序性壞死是一種可被多種外部刺激所誘發的另一種細胞死亡方式，尤其在凋亡信號被抑制時廣泛發生。RIP1-RIP3-MLKL壞死復合體是程序性壞死發生的關鍵。程序性壞死與許多疾病的發病機制有關。越來越多的證據表明抑制程序性壞死通路，可以在腦損傷等多種腦疾病中起到神經保護作用，這提供了一個很有前景的治療方向，阻斷程序性壞死信號對于防治中樞神經系統疾病有重要意義。