血漿循環游離DNA 作為腫瘤診斷標志物的研究進展

王玉樂，陽丹才讓通信作者)

（青海大學附屬醫院 肝膽胰外科，青海 西寧 810000）

0 引言

腫瘤是嚴重危害人類健康和生命的一種疾病[1]，其復發率、病死率較高，目前仍缺乏特效藥物治療，而及時有效的手術治療與預后密切相關。但因多數腫瘤患者起病隱匿，且缺乏特異性臨床癥狀，早期不易被發現，而錯失最佳手術時機。因此尋求高度敏感性和特異性的診斷標志物十分重要。近年來國內外已有較多研究表明，血漿循環游離DNA（cfDNA）作為新興腫瘤標志物的重要價值及臨床應用前景。甚至可視其為補充或替代傳統組織活檢的新方法，這使cfDNA 分析成為具有吸引力的檢測手段。本文現從cfDNA 的來源、釋放機制，檢測方法等方面來探討其在腫瘤領域中作為診斷標志物的研究進展。

1 cfDNA 的來源及釋放機制

血漿循環游離DNA（cfDNA）不僅存在于血液中，在淋巴、唾液、尿液、糞便、脊髓液和羊水中已檢測到它的存在[2]。1948年，Mandel 和Métais[3]首次在健康人和患者的血液中檢測到DNA 和RNA。在腫瘤學領域，1977 年，Leon 等[4]報道腫瘤患者體內 cfDNA 濃度高于健康人，這為腫瘤領域的生物醫學應用開辟了道路。直到1994 年研究者們從腫瘤患者外周血中檢測到了突變的RAS 基因片段[5]，至此，cfDNA 的重要意義才逐漸被重視。隨后相關研究證實了腫瘤患者血液中檢測出的突變基因片段與腫瘤組織中檢測到的結果一致[6-7]。近年來隨著研究者對cfDNA 的研究不斷深入，隨著精準醫療的提出，臨床上針對cfDNA 更多是腫瘤學領域的研究。較多研究已表明血漿cfDNA 最終可能成為腫瘤疾病的篩查、無創診斷、預后評估、治療監測和癌癥后續檢測的合適靶點[8]。但cfDNA 來源的釋放機制尚不清楚。目前認為cfDNA 主要是通過腫瘤細胞發生凋亡、壞死及分泌等方式釋放。多以凋亡為主[9]。凋亡細胞的的特征是形成梯狀條帶。相關研究[10]發現cfDNA 有凋亡特征性條帶。因此認為cfDNA 的釋放多由腫瘤細胞發生凋亡所致。此外，學者們提出的“細胞壞死假說”，“細胞分泌假說”也解釋了cfDNA 的釋放機制。腫瘤的發生、發展是極其復雜的過程，不同類型腫瘤存在各自不同特點，因此對于腫瘤患者的cfDNA 來源及釋放機制應綜合進行分析。

2 cfDNA 的檢測方法

隨著研究的不斷深入，循環腫瘤DNA(ctDNA) 濃度較低使過去的檢測手段受限，不能有效的從cfDNA 中區別出ctDNA。近年來隨著分子生物學檢測技術的發展，越來越多方法用于檢測cfDNA，且敏感性及特異性也不斷提高。目前針對cfDNA 的檢測主要基于PCR 和二代測序（NGS）的方法。兩者檢測的原理、優缺點、特異度、靈敏度各不相同，需根據研究目的靈活選擇，建立統一標準。

2.1 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測方法

qPCR 是一種在DNA 擴增反應中，以熒光化學物質實時檢測循環聚合酶鏈式反應后產物總量的方法[11]。具有操作簡便快速、靈敏度高、成本低等優點，目前是cfDNA 定量的主流方法。Punnoose 等[12]采用基于TaqMan 技術的qPCR 對25例非小細胞肺癌患者檢測，在88%的患者的中可檢測出至少一種基因突變。擴增受阻突變系統（ARMS-PCR）技術是通過在特定區域設計引物來檢測突變基因[13]。該方法檢測靈敏度高，是PCR 檢測方法的代表。Duan 等[14]使用ARMS 方法對94 例非小細胞肺癌患者進行EGFR 突變檢測，結果顯示ctDNA 與組織中檢測出的結果具有較高一致性，敏感度和特異度為50%、100%。其他基于qPCR 基礎上改良的新方法，如如 COLD-PCR、LNA / DNA-PCR、PNA clamp-PCR 也相繼被報道，但其應用的可靠性，仍需大規模的臨床驗證。

2.2 數字PCR（dPCR）檢測方法

dPCR 是核酸分子絕對定量的一種技術，被廣泛用于量化cfDNA 水平。與qPCR 相比，兩者技術上類似，但對核酸分子定量方式差別較大[13]。dPCR 技術具有更高的準確性、靈敏度及重復性。其中以磁珍乳液擴增發（BEAMing）為代表。BEAMing 技術是數字PCR 結合流式細胞術的檢測方法。這種技術主要有小珠、乳濁液、擴增、磁性4 部分組成。Thress等[15]利用BEAMing 技術對72 例EGFR 基因突變陽性的肺癌患者進行檢測，其敏感性達82%-87%，特異性達100%。但該檢測技術成本高、操作復雜，且會增加實驗誤差，目前臨床應用率低。此外微滴數字PCR（ddPCR）也在腫瘤中得以應用，對cfDNA 的檢測有良好效果。

2.3 高通量測序技術（NGS）

NGS 技術又稱二代測序技術，它使得在保證敏感性的基礎上檢測出ctDNA 中腫瘤特異性基因突變成為可能。這種高通量測序具有非常高的敏感性，能精確檢測到治療過程中ctDNA的變化，是目前公認最有效的分析方法[16]。全基因組測序、全外顯子測序、標記擴增深度測序（TAM-Sep）、腫瘤個體化深度測序（CAPP-Seq）已用于腫瘤的檢測。其中以TAM-Sep 和CAPP-Seq 為代表。TAM-Sep 技術是利用定制化突變位點庫作為篩選器，對樣本進行靶向捕獲后再進行深度測序，靈敏度及特異度更強[17]。據報道[9]此方法檢測出突變率達2%，特異性高達97%，還能發現腫瘤中新型未知突變。CAPP-Seq 屬于一種捕獲測序技術。其基本原理是利用特異性引物進行目標區域擴增，再利用不同特性接頭標簽二次擴增。通過對樣本行雙重深度測序，提高特異性及敏感性。該技術對ctDNA 的檢測特異度最高，適用于臨床應用[13]。然而，NGS 在臨床中的應用還存在很多問題，該技術的昂貴和龐大數據的處理，以及高質量的樣本的采取仍是目前需要解決的問題。

3 cfDNA 在腫瘤診斷中的進展

目前cfDNA 被認為是腫瘤領域最具發展潛力的分子標志物。很多腫瘤從發病初期到晚期需20-30 年時間，而早期發現腫瘤，尤其在影像學診斷出腫瘤之前發現病變是世界性難題。而對人體血液中cfDNA 的檢測，使得在影像學尚未發現病灶時就提示腫瘤存在成為可能。通過對乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌、肺癌和胰腺癌等多種腫瘤的研究，認為cfDNA 是一種潛在的腫瘤早期診斷、預后判斷、療效評估的有利手段。尤其對于腫瘤轉移患者，組織活檢有禁忌癥的患者，cfDNA 的檢測替代組織活檢將成為可能。

3.1 cfDNA 與乳腺癌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。多項研究已經表明cfDNA 檢測在出現癥狀前期具有早期發現乳腺癌的潛力[18-19]。Beaver 等[18]使用ddPCR 技術對29 例早期乳腺癌患者手術前后血漿ctDNA 進行了分析，發現有15 例PIK3CA腫瘤基因突變，其中14 例在術前的cfDNA 中檢測到。對14例患者中的10 例進行術后檢測cfDNA，其中5 例術后仍可檢測到PIK3CA 突變。在早期乳腺癌手術前后可使用ddPCR技術檢測ctDNA，促進乳腺癌的早期診斷。Olsson 等[20]應用ddPCR 技術連續監測20 例早期乳腺癌患者的ctDNA，發現監測ctDNA 預測腫瘤復發的準確率高達93%，比臨床發現復發轉移早11 個月。ctDNA 檢測能預測復發乳腺癌患者化療的風險，能為個體化治療方案的制定提供依據。cfDNA 在乳腺癌的早期篩查、診斷、預后和治療中具有潛在的應用價值。

3.2 cfDNA 與結直腸癌

結直腸癌是世界第三大最常見的癌癥類型，也是癌癥死亡的第四大原因[21]。約一半結直腸癌患者診斷時已處于晚期，顯著降低了治療的有效性。已有研究表明ctDNA 可能是結直腸癌可靠預后因素，可作為殘留病變的非侵入性標志物。Cassinotti[22]和Frattini 等[23]觀察到結直腸癌初次手術切除后cfDNA 濃度明顯降低，但復發患者cfDNA 水平顯著升高。這表明術后檢測cfDNA 可能是早期發現癌癥復發的一種很有前途的工具。Diehl 等[24]研究發現術后可檢測到ctDNA 的結直腸癌患者一般在1 年內出現復發，認為ctDNA 是腫瘤的特異性生物標志物。cfDNA 的檢測在結直腸癌中的應用也具有很好的前景。

3.3 cfDNA 與肺癌

肺癌是世界癌癥死亡的主要原因。手術是早期肺癌患者首選的治療方法，其次是輔助治療。然而，復發是常見的，臨床上迫切需要能夠預測癌癥復發風險的生物標記物，以優化治療策略。Wenwei 等[25]在一項前瞻性研究中表明肺癌的大多數EGFR 基因突變可以在患者血漿中檢測到，EFGR 基因突變水平可能是判斷手術治療預后的生物標志。早期肺癌患者血漿中EGFR 基因突變具有獨立的診斷價值和預后價值。迄今為止，已有多項研究表明cfDNA 中檢測到的EGFR 基因突變與非小細胞肺癌患者腫瘤組織中檢測到的基因突變高度一致。2016 年，ctDNA 已被美國FDA 批準作為首次液體活檢（cfDNA 檢測）試驗來鑒定具有EGFR 基因突變的非小細胞肺癌患者[26]。這表明cfDNA 在肺癌診斷、預后及指導個體化治療方面具有重要的意義。

4 小結與展望

近年來，隨著分子生物技術的不斷發展，cfDNA 作為腫瘤的一類重要分子標志物正在從研究領域向臨床應用轉化。cfDNA 在腫瘤中的診斷、療效評估、復發預測及治療方案選擇等方面具有重要價值。然而，目前仍有較多問題需進一步探索及研究，如cfDNA 的分析缺乏統一標準，且cfDNA 濃度低，檢測時可受到其他非腫瘤疾病的影響而產生假陽性等。盡管二代測序是目前檢測cfDNA 最有效的方法，但昂貴的費用及龐大的數據處理，使其臨床應用一定程度上受限。相信未來通過更多、更大樣本量的研究及檢測技術的不斷進步，這些問題將逐步得到解決。