氮雜-2'-脫氧胞苷在肺癌中的研究進展

蘆超遠，杜振宗

( 1.桂林醫學院研究生學院，廣西 桂林 541002；2.廣西壯族自治區南溪山醫院胸外科，廣西 桂林 541002)

0 引言

癌癥發生的重要機制之一是抑癌基因啟動子CpG 島的高甲基化所引起的抑癌基因沉默[5-6]。DNA 甲基化是指在DNA 甲基轉移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基基團轉移到胞嘧啶- 磷酸- 鳥嘌呤二核苷酸中胞嘧啶的第5 位碳原子上[7]，其在肺癌發生發展過程中發揮著重要作用；甲基化抑制藥5-氮-2'-脫氧胞苷已在骨髓增生異常綜合征、急慢性髓細胞白血病等血液系統惡性腫瘤化療中得到部分應用，并取得一定療效；近年來眾多研究表明，5-氮-2'-脫氧胞苷對多種肺癌抑癌基因表達及細胞調亡產生影響。因此本文對5-氮-2'-脫氧胞苷在肺癌肺癌最新研究進展做一綜述。

1 5-氮-2 '-脫氧胞苷介紹

5- 氮-2’- 脫氧胞苷是一種胞嘧啶核苷的類似物，由胞嘧啶環上第 5 位碳原子被氮原子取代而形成。研究表明，5-aza-CdR 在摻入DNA 后與甲基化轉移酶DNMT 形成不可逆的共價鍵，使 DNMT 的活性受到抑制，從而DNA 甲基化無法維持[12]。此外除了去甲基化作用外，5-aza-CdR 還可以引起DNA 損傷[13]，已有研究表明 5-aza-CdR 可引起單鏈DNA損傷[14]，近期也有報道認為 5- aza-CdR 可引起雙鏈 DNA 損傷[15]，在抗腫瘤中起重要作用。

2 5-氮-2 '-脫氧胞苷與肺癌抑癌基因

大量研究表明5-氮雜-2’-脫氧胞苷( 5-Aza-CdR) 作為目前體外最常用且作用最強的一種甲基化抑制劑，通過去甲基化作用可重新激活表達缺陷的RAR-βW1F1、RASSF2A等抑癌基因，從而使mRNA 及蛋白表達水平明顯上調，發揮抑癌作用。

2.1 CDH13 基因

CDH13 是由每個脊椎動物基因組中的一個基因編碼的，是鈣黏著蛋白超家族的一個新成員，該基因位于染色體16q24[16]。對維持正常組織結構具有重要意義。在人類惡性腫瘤中發現了CDH13 基因的異常[17,18]。此外，CDH13的異常表達與其啟動子甲基化在肺癌中的關系已經被證明[19-21],Liao 等[22]用 5-Aza-d C 處理體外培養的肺癌細胞 A549、LTEP-a2 及正常肺細胞系HFL1 后，用甲基化特異性 PCR( MSP) 法檢測處理前后細胞中CDH13 基因的甲基化狀態，半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應( RT-PCR) 法檢測用藥前后細胞中CDH13 mRNA 表達的變化；結果顯示CDH13 啟動子甲基化在兩株癌細胞系均被檢測到，而正常肺細胞系HFL1未被檢測到；5-Aza-dC 處理后的肺癌細胞明顯出現去甲基化現象；RT-PCR 檢測細胞中CDH13 mRNA 的表達結果為：且經5-Aza-dC 處理后癌細胞系CDH13 mRNA 表達增強，而正常肺細胞系HFL1 經5-Aza-dC 處理后CDH13 的表達無明顯改變；因此得出CDH13 基因的甲基化狀態可被去甲基化制劑5-Aza-dC 逆轉，激活CDH13 基因表達，抑制CD13 的甲基化可成為肺癌治療的一種方式。

2.2 TFPI-2 基因

TFPI-2 基因 組織因子通路抑制劑-2(TFPI-2) 也稱胎盤蛋白-5，是一種含有kunits 型結構的絲氨酸蛋白酶抑制物超家族成員，參與維護細胞外基質(ECM) 結構的完整性，具有抑制腫瘤及其血管生成、誘導細胞凋亡等多種生物學功能; 研究表TFPI-2 在大多數侵襲性腫瘤中被下調，如膠質瘤[23]、非小細胞肺癌[24,25]、乳腺癌[26]、黑色素瘤[27]、結直腸癌[28]、胰腺癌[29]、肝細胞癌[30]。TFPI-2 基因被認為是一種潛在的抑癌基因。Dong 等人[31]用不同濃度 5-Aza-d C 處理體外培養的肺癌細胞，甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSPCR)、實時聚合酶鏈反應( 實時PCR) 和western blotting 法測定TFPI-2 基因甲基化狀態、mRNA 表達和蛋白表達。得出TFPI-2 基因啟動子甲基化導致非小細胞肺癌細胞A549 中TFPI-2、m RNA 和蛋白表達的丟失，5-Aza-CdR處理可誘導非小細胞肺癌細胞的去甲基化。并恢復TFPI-2基因的表達。

2.3 RAR-B-β 基因

RAR-β 基因位于染色體3p24 上，通過表達產物視黃酸受體( retinoicacid receptor，RAR)，與視黃酸(RA) 結合來調節靶基因轉錄，進而影響細胞分化、增殖和凋亡。RAR-β 基因的表觀遺傳學改變導致其在多種腫瘤細胞中表達缺陷，引起癌癥發生[32]; 為潛在肺癌抑癌基因[33]LI[34]等人采用實時甲基化特異性PCR(MSP) 方法檢測；使用不同濃度及未使用5- 氮-2 '- 脫氧胞苷4 組人肺腺癌細胞株甲基化狀態，研究發現，除未加藥時RAR-β 均產生明顯甲基化條帶，其余三組同批次癌細胞株在加入不同濃度5-Aza-CdR 處理后均檢測出不同程度RAR-β 去甲基化；理論上，應證了癌基因的高甲基化是一個可逆轉的過程；可以通過應用去甲基化藥物如5- 氮-2 '- 脫氧胞苷可重新激活因甲基化而失活的R A R-β 抑癌基因；同時該研究還發現：4 組不同狀態下使用RT-PCR 及Western blot 法檢測用藥前后RAR-β基因mR-NA 及蛋白表達的變化，結果顯示未加藥時的RAR-βmRNA 及RAR-β 蛋 白 表 達 水 平 低 下(P＜0.01) ，隨著5-Aza-CdR 處理濃度的加大，RAR-βmRNA 及RAR-β蛋白表達水平逐漸提高( P＜0.05)，且于5-Aza-CdR 量效成一定的相關性；進一步論證了應用去甲基化藥物5- 氮-2 '-脫氧胞苷可使因甲基化而沉默的R A R-β 抑癌基因重新表達視黃酸受體蛋白，發揮抑癌效應。

2.4 P16

P16 基因又稱細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2,是細胞周期G1 期重要的負調節因子, 通過對細胞周期蛋白依賴性激酶 4 和6 介導的Rb 蛋白磷, 從而抑制細胞的增殖, 以起到促進細胞凋亡以及防止癌變, 是一種多腫瘤抑制基因[35], HUA 等人[36]用免疫組化SP 法檢測76 例非小細胞肺癌組織及癌旁正常組織中p16 蛋白的表達情況，用MSP 法檢測經5-Aza-CdR 處理A549 細胞p16 基因啟動子區DNA 甲基化狀態，最后用Westernblot 法檢測P16在5-Aza-CdR 的作用A549 肺癌細胞中的表達。結果得出在A549 細胞中，隨著5-Aza-CdR 濃度增加后p16 蛋白和非甲基化表達產物上調。FANG[37]通用用實驗證明了SPC-A-1 細胞中沉默的p16 基因重新表達, 且呈濃度依賴性。

除 此 之 外，MGMT、MGMF、WIFI、RASSF2A 等 肺 癌抑癌基因均被證實在5-Aza-CdR 作用下出現明顯的去甲基化。

3 總結與展望

傳統肺癌治療以手術、放療、化療為主，效果及其預后均較差，5 年生存率僅為 16.1%[3]；5-Aza-CdR 是一種新型表觀遺傳學抗腫瘤藥物，除具有強大的去甲基化作用，還可通過組蛋白修飾及細胞毒性作用從而使腫瘤細胞周期阻滯、細胞凋亡從而達到抗腫瘤作用。此外5-Aza-CdR 影響肺癌抑癌基因甲基化研究表明，去甲基化程度與5-Aza-CdR 的濃度成一定相關性；臨床研究也表明，低劑量的5-Aza-CdR 單藥化療并不能有效抑制腫瘤的進展，高濃度的5-Aza-CdR 雖可顯著的抑制腫瘤進展，但出現明顯的毒副作用如易產生骨髓抑制等；探尋最佳的劑量，也是下一步研究的目標；另外5-Aza-CdR 為非特異性的去甲基化藥物，對原癌基因甲基化狀態是否有影響？需要進一步實驗研究。5-Aza-CdR 目前只在血液系統惡性腫瘤化療得到臨床應用，實體腫瘤如肺癌臨床化療中的應用極少，5-Aza-CdR 雖能有效的使眾多肺癌抑癌基因發生去甲基化等發揮抗腫瘤作用，但肺癌的發生機制尚未完全明確。5-Aza-CdR 為肺癌的治療提供了一種可能。