基于牙髓干細胞的神經系統疾病治療新進展

程晨 彭杉 楊桐 綜述 丁剛 審校

中樞神經系統和周圍神經系統共同傳輸和處理感官信息，并控制和調節各系統器官的活動。創傷、腦缺血、神經退行性疾病等可以導致神經系統的炎癥、軸突變性、神經元細胞結構畸形甚至死亡，嚴重影響患者身體健康和生活質量。由于神經前體細胞數量有限[1-3]，傳統的治療方法在神經元功能恢復方面療效有限。干細胞是一類具有自我更新和高度分化潛能的細胞，能夠分化為各種類型的功能細胞，基于干細胞的治療策略為神經再生和修復提供了新的手段。其中，來源于神經嵴的牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)具有神經分化的潛能，在一定條件下，能被誘導成神經元或神經樣細胞，并且能分泌多種神經營養因子，為治療神經系統疾病和損傷提供了可能[4]。

1 DPSCs特性

1.1 DPSCs的培養

2000 年Gronthos等[5]首先從牙髓組織中分離并鑒定DPSCs，具有與骨髓間充質干細胞有相似免疫表型，能夠自我更新和多向分化，具有較高的細胞增殖率和克隆形成能力。DPSCs一般分離自正常的阻生第三磨牙或者正畸減數牙，且多采用酶消化法進行原代培養[5-6]。

1.2 DPSCs的神經特性

DPSCs來源于顱神經嵴，可以在體外誘導為神經細胞，具有類似功能神經元的特征，比其他組織來源的間充質干細胞具有更強大的神經分化潛力[7-8]。Gonmane等[9]將DPSCs誘導為神經前體細胞，與包含耳蝸核的聽覺腦干切片共培養，其神經元分化的特異性標記物原肌球蛋白受體激酶、GATA結合蛋白3及突觸小泡蛋白高表達，并表現出細胞內鈣震蕩，這些實驗結果表明自體DPSCs為感音神經性聽力損失患者提供了新的治療方法[9]。另有研究證明，DPSCs可以通過形成神經球而分化為多巴胺能神經細胞，為治療帕金森病提供了可能[10]。與骨髓和脂肪間充質干細胞相比，DPSCs在體內外具有更高的增殖率，高表達并分泌神經營養因子，表現出更優異的神經保護和神經支持特性[11-12]。Geng等[13]研究者用白藜蘆醇處理DPSCs，并與在神經元誘導培養基中培養的DPSCs比較，發現兩組DPSCs的神經元特異性標記物(巢蛋白和神經絲蛋白)的mRNA表達和蛋白表達均上調，表明白藜蘆醇具有與神經元誘導培養基相近的誘導DPSCs 神經元向分化作用。隨著人們對DPSCs的深入研究，越來越多的臨床前動物模型實驗證明DPSCs在治療神經系統疾病方面具有顯著療效，DPSCs可以在適當的條件下分化為神經元樣細胞，并且分化的細胞表現出典型的電生理特性[14-15]。與之相反的是，胚胎干細胞和誘導多能干細胞修復神經損傷方面的證據尚不夠充分[16]，且存在腫瘤形成、免疫排斥、倫理爭議等問題[17], 因此DPSCs是一個促進神經修復和保護神經特性的良好細胞來源。

2 DPSCs治療神經系統疾病的效果

多種體外、體內模型實驗證明，DPSCs對神經系統疾病具有良好的治療作用(表1)。

2.1 腦中風

Nito等[18]將DPSCs注入大鼠大腦中動脈阻塞模型，發現DPSCs顯著抑制了小膠質細胞的活化和炎性細胞因子的表達，腦梗塞面積明顯減少，運動功能障礙得到逆轉，皮質缺血邊界區域的神經元變性明顯減輕。另有研究發現，絲裂原活化蛋白激酶和轉化生長因子β信號通路參與了DPSCs介導的腦中風治療，且DPSCs的治療作用強于骨髓間充質干細胞[19]。Kota等[20]使用過表達肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)的DPSCs治療大腦中動脈阻塞的大鼠，發現過表達HGF增強了DPSCs缺血/再灌注后腦損傷的治療作用，顯著抑制小膠質細胞活化、炎性因子表達和神經元變性，減少腦梗塞面積，改善運動功能。再灌注后，過表達HGF的DPSCs能增加緊密連接蛋白，維持血腦屏障的完整性，并增加腦梗塞周圍區域的微血管密度。Chiu等[21]將免疫分選的胰島素樣生長因子1受體陽性(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)的DPSCs移植到缺血缺氧性腦病新生大鼠的腦中，發現DPSCs能夠神經向分化，誘導神經突的再生，改善大鼠的神經行為，促進神經的可塑性和神經功能恢復。此外，有研究者將DPSCs衍生的神經球細胞移植入重度前腦缺血性損傷的大鼠腦內，發現DPSCs能提供神經保護作用，腦缺血顯著改善，海馬區神經元細胞死亡減少，提高了動物的運動功能、認識功能和總體生存率[22]。Nagpal等[23]主持了自體DPSCs治療慢性中風患者的安全性和可行性的臨床研究，不過最終結果尚未報道。

2.2 帕金森病

帕金森病(parkinson disease，PD)是一種常見的錐體外系變性疾病，主要病理特征是黑質致密部多巴胺能神經元的早期凋亡，臨床表現為運動遲緩、步態障礙、僵硬和靜息性震顫。因為其神經嵴來源、免疫調節作用、分泌神經營養因子、誘導軸突導向(axon guidance)、分化為功能性神經元等特性，DPSCs可成為PD治療的細胞來源，為基于干細胞移植的PD治療提供一種比較可靠的途徑，在PD治療中有潛在的應用價值[24]。Fujii等[25]將人脫落乳牙來源的DPSCs移植入6-羥基多巴胺(6-Hydroxydopamine ,6-OHDA)誘導的大鼠PD模型中，發現DPSCs主要通過旁分泌機制促進PD大鼠神經功能的恢復，增加多巴胺水平，增強了內源性多巴胺能神經元的神經保護作用，促進了黑質紋狀體的恢復。另有研究用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine , MPTP)誘導PD體外模型，與DPSCs在Transwell條件下共培養，發現DPSCs能減少該模型活性氧和一氧化氮產生，減輕DNA損傷，抑制促炎因子的表達，在PD體外模型的治療中發揮神經保護和免疫調節的作用[26]。Chen等[27]將DPSCs條件培養基經尾靜脈注入魚藤酮誘導的大鼠PD模型，發現能夠改善PD癥狀，增加紋狀體酪氨酸羥化酶的表達，降低黑體和紋狀體的α-突觸核蛋白水平，進一步研究發現DPSCs條件培養基的治療作用是通過調節膽堿能突觸、鈣信號通路和血清素能突觸來實現的。

2.3 阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(alzheimer disease，AD)是常見的神經退行性疾病之一，臨床表現主要為癡呆和智力下降，主要病理變化為β-淀粉樣肽沉積和Tau蛋白磷酸化[28]。Wang等[29]用大田軟海綿酸作用于人成神經細胞瘤細胞系(SH-SY5Y)來制備AD細胞模型，然后將DPSCs與AD細胞模型進行Transwell共培養，發現AD體外模型的細胞活力升高、凋亡減少，收縮的樹突重現再拉長，微絲緊密排列，微管纖維增厚，Tau蛋白的Ser 396磷酸化顯著受到抑制。另有研究顯示DPSCs分泌血管內皮生長因子、單核細胞趨化蛋白1、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等細胞因子，顯著降低β-淀粉樣肽的細胞毒性，刺激凋亡抑制因子Bcl-2的生成，并降低凋亡促進因子Bax，從而使細胞凋亡減少，說明DPSCs有望成為治療AD的候選藥物[30]。Zhang等[31]將淀粉樣蛋白-β1-42注入大鼠海馬回制備AD模型，然后把DPSCs注射入海馬回，發現神經元相關的雙皮質素、特異性核抗原蛋白和神經絲蛋白200表達升高，β-淀粉樣肽水平降低，且動物的認知能力和行為能力顯著地改善，作者認為DPSCs通過調節神經元相關蛋白的分泌改善了AD的癥狀。

2.4 肌萎縮性側索硬化癥

肌萎縮性側索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是上下運動神經元進行性丟失為特征的一種神經系統變性病，涉及中樞神經膠質與周圍免疫反應和神經肌肉接頭之間復雜的相互作用關系。研究者將DPSCs條件培養基注射到mSOD1G93AALS小鼠動物模型的腹腔內，結果顯示，無論在疾病的哪個階段注射DPSCs條件培養基，都能明顯促進神經肌肉接頭部位的神經支配，防止運動神經元丟失并延長了動物的壽命，而灰質前角部位的反應性神經膠質分裂并不受影響。關于DPSCs治療ALS的機制，作者考慮與DPSCs分泌的各種因子對運動神經元胞體和神經肌肉接頭部位的神經營養作用有關[32]。

2.5 脊髓損傷

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是脊柱損傷中最嚴重的并發癥，在損害的相應節段出現各種運動、感覺和括約肌功能障礙，肌張力異常等的相應改變。脊髓損傷不僅給患者本人帶來身心的嚴重傷害，而且對社會造成嚴重的經濟負擔。一項體內研究試驗表明，將DPSCs注入完全橫斷的大鼠脊髓模型，發現DPSCs能減少炎癥性損傷，促進軸突再生，并減少SCI后的進行性出血性壞死，且有部分DPSCs在體內存活并分化為成熟神經元和少突膠質細胞，從而促進了SCI鼠的運動功能恢復。至于相關機制，作者認為與DPSCs抑制白細胞介素-1β、Ras Homolog基因家庭成員A和磺酰脲受體1的表達相關[33]。另有研究表明，將預先血管化的DPSCs植入大鼠受損的脊髓中，可以促進血運重建及軸突再生，恢復髓磷脂蛋白的沉積和感覺功能，具有血管生成和神經營養潛力，對SCI具有明顯的改善和調節作用，DPSCs的促血管形成和神經營養特性發揮了主要作用[34]。Zhang等[35]將DPSCs與殼聚糖支架復合，然后移植到SCI大鼠，發現顯著促進了腦源性神經營養因子、神經膠質細胞源性的神經營養因子和神經營養因子-3的分泌，抑制細胞凋亡，促進了大鼠的后肢運動功能恢復，Wnt/β-catenin信號通路介導了DPSCs的治療作用。

2.6 周圍神經損傷

DPSCs可作為種子細胞構建組織工程的人工神經。在一項研究中，將兔的DPSCs注入兔面神經損傷處，明顯改善了面神經功能的恢復，兔再生神經纖維數量增多，纖維直徑和髓鞘厚度增加，其修復機制可能與神經營養因子表達上調有關[36]。研究者制備大鼠面神經擠壓傷模型，并局部注射DPSCs，14 d后大鼠的耳語動作恢復，組織學檢查顯示，軸突變性和無髓鞘軸突減少，神經纖維脫髓鞘減少，髓鞘排列規則，研究者認為神經生長因子發揮了重要作用[37]。研究者將DPSCs輸入大鼠坐骨神經缺損模型，發現DPSCs可以遷移到神經缺損處，并表達施萬細胞的標記物 S1 00b，移植后1 個月可見顯著的軸突再生[38]。

研究者用鏈脲霉素誘導糖尿病大鼠模型，48 周后，將DPSCs注射到動物后肢的骨骼肌處(共10個注射點)。注射4 周后，局部的運動/感覺神經傳導速度明顯加快，電流感覺閾值降低，骨骼肌毛細血管密度增加，表皮內神經纖維密度增加，髓磷脂厚度增加，背根神經節神經元的神經突外伸生長明顯，施萬細胞的髓磷脂相關蛋白表達升高，DPSCs通過分泌神經營養因子改善了糖尿病引起的神經病理學改變[39]。

3 總 結

綜上所述，DSPCs作為組織工程的種子細胞來源具有較多優勢，在神經系統疾病的修復和再生方面有良好的應用前景，但是將DPSCs 用于神經系統疾病的臨床治療仍面臨很大的挑戰：(1)目前仍然沒有得到一致認可的DPSCs體外神經誘導分化方案；(2)目前絕大多數研究主要是利用體外模型和嚙齒類動物模型，在大動物模型的研究較少；(3)DSPCs能分泌多種生物活性因子，這些生物活性因子相互作用且作用復雜，它們在DSPCs介導的神經修復與再生方面發揮的作用尚不明確；(4) DSPCs治療神經系統疾病的相關作用機制的研究較少，且機制不明確。只有這些問題有了滿意的答案，才能夠進行下一步臨床研究，DSPCs才能安全、有效地治療神經系統疾病。