竹莖稈快速生長(zhǎng)期淀粉分解相關(guān)酶基因表達(dá)的分析

栗青麗，王靈杰，高培軍，韋賽君，呂嘉欣，高 巖，張汝民

（浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

碳水化合物是自然界分布最廣的物質(zhì)之一，是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中構(gòu)成碳骨架，提供能量的主要物質(zhì)，同時(shí)起到滲透調(diào)節(jié)和信號(hào)傳導(dǎo)的作用[1]。STITT等[2]研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥Arabidopsisthaliana白天同化的碳以淀粉形式積累，夜間淀粉轉(zhuǎn)化成可溶性糖為生長(zhǎng)提供能量，黎明前幾乎完全利用。PANTIN等[3]研究擬南芥幼嫩葉片生長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)：夜間生長(zhǎng)由于受到碳的限制，生長(zhǎng)速度慢于白天。GRAF等[4]研究擬南芥葉片淀粉代謝發(fā)現(xiàn)：夜間淀粉降解模式受生物鐘調(diào)控。擬南芥植株淀粉代謝研究中顯示，糖代謝和淀粉降解可受光周期長(zhǎng)度的影響[5?8]。RIOU-KHAMLICHI等[9]研究擬南芥幼苗生長(zhǎng)發(fā)現(xiàn)：糖作為一種信號(hào)物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白CYCD2和CYCD3的表達(dá)。糖代謝和淀粉降解是由一系列酶介導(dǎo)的。STREB等[10]研究擬南芥瞬時(shí)淀粉分解發(fā)現(xiàn)：α-淀粉酶[α-Amylase (AMY)]、極限糊精酶[limit dextrinase(LDA)]及異淀粉酶3[isoamylase 3(ISA3)]相互獨(dú)立地直接作用于淀粉顆粒。植物葉片淀粉分解過(guò)程α-淀粉酶作用不明顯，而β-淀粉酶[β-Amylase(BAM)]起關(guān)鍵作用[11?14]。小麥Triticumaestivum和煙草Nicotianatabacum種子萌發(fā)過(guò)程中淀粉酶活性和AMY基因表達(dá)量逐漸上升，導(dǎo)致淀粉降解加速，可溶性總糖含量逐漸增加[15?16]。MARUYAMA等[17]研究擬南芥中mRNA水平，發(fā)現(xiàn)脫水和冷脅迫分別導(dǎo)致bam1和bam3表達(dá)增加。ISA3和LDA、AMY3和BAM等共同協(xié)調(diào)糖和淀粉的合成與分解[2]。近年來(lái)，毛竹Phyllostachysedulis的生理生態(tài)研究取得了許多進(jìn)展，主要涉及光合作用、組織構(gòu)造、糖的時(shí)空變化、不同生長(zhǎng)期莖稈色素含量等方面[18?21]，而對(duì)毛竹快速生長(zhǎng)期分子水平的調(diào)節(jié)機(jī)制研究較少。因此，本研究以毛竹筍竹快速生長(zhǎng)期的莖稈為材料，分析了非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(nonstructural carbohydrate, NSC)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化，AMY和BAM的活性以及PeAMY和PeBAM基因表達(dá)模式，為進(jìn)一步揭示毛竹快速生長(zhǎng)期的調(diào)節(jié)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在2019年4月下旬毛竹快速生長(zhǎng)階段，選取生境條件一致、生長(zhǎng)狀況良好和高度在(3.0±0.2) m的毛竹筍竹30株，從10:00開(kāi)始每隔4 h隨機(jī)取5株，每株作為1個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，共5次重復(fù)。將莖稈從基部往上每間隔2節(jié)依次編號(hào)為 1、4、7、10、13、16、19、22。采樣后在液氮中冷凍，之后放入?80 ℃超低溫冰箱內(nèi)備用。

1.2 方法

1.2.1 可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 稱取毛竹莖稈0.5 g，研磨至勻漿，加蒸餾水9 mL，沸水浴提取10 min，不斷攪拌。冷卻，3 000 r·min?1離心5 min，取上清液。葡萄糖、果糖和蔗糖分別采用葡萄糖試劑盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn))、果糖和蔗糖試劑盒(南京建成科技有限公司生產(chǎn))測(cè)定。具體方法參照說(shuō)明書。

1.2.2 淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 將上述可溶性糖提取后的沉淀用體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇沖洗1遍，加蒸餾水3 mL，攪拌均勻，沸水15 min。冷卻后，加入9.2 mmol·L?1冷高氯酸4 mL，攪拌提取20 min，蒸餾水定容25 mL，混勻，3 000 r·min?1離心10 min。取上清液，測(cè)定方法采用蒽酮硫酸法。

1.2.3 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定 參照BRADFORD[22]方法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.4 α，β-淀粉酶活性測(cè)定 稱取毛竹莖稈 0.5 g，加 10 mL 檸檬酸緩沖液 (0.1 mol·L?1, pH 7.0)，冰浴研磨，放在常溫下充分提取15～20 min，10 000 r·min?1離心10 min(4 ℃)，上清液為酶提取液。采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定酶活力。40 ℃恒溫水浴保溫15 min，測(cè)定總淀粉酶活性，70 ℃加熱15 min，鈍化β-淀粉酶，測(cè)定α-淀粉酶活性。酶活力以1 min分解淀粉形成1 mol麥芽糖所需酶量為1個(gè)活性單位，以 U·g?1·min?1(1 U=16.67 nkat)表示。

1.2.5 麥芽糖酶活性測(cè)定 稱取毛竹莖稈0.5 g，用 MES 緩沖液(20 mol·L?1, pH 6.2)進(jìn)行提取，冰浴研磨，提取定容至5 mL，10 000 r·min?1離心10 min(4 ℃)，上清液為酶提取液。酶活性測(cè)定采用麥芽糖酶試劑盒(南京建成科技有限公司生產(chǎn))。具體方法參照說(shuō)明書。

1.2.6 基因表達(dá)檢測(cè) ①RNA 提取。稱取樣品0.5 g，使用寶生物工程(大連)有限公司RNAiso Plus試劑盒提取RNA。微量分光光度計(jì)檢測(cè)樣品RNA的濃度和純度，1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量。②反轉(zhuǎn)錄及cDNA質(zhì)量檢測(cè)。采用寶生物工程(大連)有限公司PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser(perfect real time)試劑盒。具體方法參照說(shuō)明書。③cDNA全長(zhǎng)及啟動(dòng)子克隆。參照毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中PeAMY和PeBAM基因序列設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)和定量引物(表1)，選擇毛竹NTB基因作為內(nèi)參基因。具體方法參照說(shuō)明書。④基因表達(dá)檢測(cè)(qRT-PCR)。采用寶生物工程(大連)有限公司SYBR Premix ExTaqTM(perfect real time)試劑盒。具體方法參照說(shuō)明書。

表 1 引物信息Table 1 Primer information

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為5次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。熒光定量數(shù)據(jù)按照下列公式計(jì)算：相對(duì)表達(dá)量=2?ΔΔCt[23]，使用內(nèi)參基因校正拷貝數(shù)，利用Origin 9.0軟件(Origin Lab公司, 美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NSC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

由圖1A可以看出：隨時(shí)間變化，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)白天較高，18:00之后逐漸降低，第7節(jié)和第10節(jié)2:00分別比18:00降低了25.4%和27.2%(P＜0.01)。第13節(jié)和第16節(jié)變化不顯著。由圖1B可以看出：隨時(shí)間推移，第7節(jié)和第10節(jié)果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)白天較高，18:00后極顯著下降，2:00最低，與18:00相比分別降低了50.0%和34.1%(P＜0.01)，之后極顯著上升，6:00比2:00分別高出64.7%和50.6%(P＜0.01)。第13節(jié)和第16節(jié)變化不顯著。由圖1C可以看出：蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第7節(jié)和第10節(jié)較高，第13節(jié)和第16節(jié)較低且變化不顯著。第7節(jié)和第10節(jié)白天蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，18:00后極顯著下降，2:00最低，分別比18:00低了49.8%和27.4%(P＜0.01)。如圖1D所示：淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第7節(jié)和第10節(jié)較低，第13節(jié)較高，第16節(jié)最高且變化不明顯。第7、10和13節(jié)白天淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，18:00達(dá)最高，之后逐漸下降，6:00分別比18:00降低了27.3%、23.2%和24.0%(P＜0.01)。

2.2 酶活性的變化

如圖2A所示：AMY活性差異不顯著，整體無(wú)明顯變化規(guī)律。如圖2B所示：BAM活性第7、10和13節(jié)較高，第16節(jié)活性低且變化不顯著。白天BAM活性較穩(wěn)定，18:00后活性較高且在22:00達(dá)最高，第7、10和13節(jié)22:00活性分別比18:00高90.5%、76.7%和50.5%(P＜0.01)，之后活性極顯著下降，6:00與22:00 相比分別降低了56.2%和62.6%和51.1%(P＜0.01)。

如圖3所示：麥芽糖酶的活性在第7、10和13節(jié)較高，第16節(jié)活性最低且變化不顯著。白天麥芽糖酶的活性較穩(wěn)定，18:00后活性較高且在22:00達(dá)最高，第7、10和13節(jié)22:00分別比18:00高 2.5，2.2和 1.4倍 (P＜0.01)，之后第7節(jié)和第10節(jié)極顯著下降，6:00分別比22:00降低了27.2%(P＜0.01)和19.4%(P＜0.05)。

圖 1 毛竹莖稈不同節(jié)間碳水化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的日變化Figure 1 Diurnal variation of carbohydrate contents in different internodes for stems of Ph.edulis

圖 2 毛竹莖稈不同節(jié)間淀粉酶活性的日變化Figure 2 Diurnal variation of amylase activity in different internodes for stems of Ph.edulis

圖 3 毛竹莖稈不同節(jié)間麥芽糖酶活性的日變化Figure 3 Diurnal variation of maltase activity in different internode for stems of Ph.edulis

2.3 基因表達(dá)模式

如圖4A所示：PeAMY基因表達(dá)不顯著，整體無(wú)明顯變化規(guī)律。如圖4B所示：PeBAM基因在第7節(jié)和第10節(jié)表達(dá)量較高，第13節(jié)表達(dá)量相對(duì)較低，第16節(jié)表達(dá)量最低且變化不顯著。白天基因表達(dá)量低，18:00后表達(dá)量極顯著上升，2:00達(dá)最高峰。第7、10和13節(jié)2:00分別比18:00高1.8、1.8和1.7倍(P＜0.01)，之后表達(dá)量下降，6:00分別比2:00降低了20.1%、15.2%和21.7%(P＜0.05)。

圖 4 毛竹莖稈不同節(jié)間淀粉酶基因表達(dá)的日變化Figure 4 Diurnal variation of amylase gene expression in different internode for stems of Ph.edulis

3 討論

碳水化合物是參與植物代謝的主要能量物質(zhì)，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育中起關(guān)鍵性作用[24]。GRAF等[7]研究玫瑰Rosarugosa花中碳水化合物晝夜節(jié)律控制發(fā)現(xiàn)：淀粉含量在光照下增加，黑暗中逐漸下降。IZUMI等[25]研究擬南芥葉片發(fā)現(xiàn)：白天積累的淀粉在夜間逐漸減少，夜間幾乎完全消耗，蔗糖、葡萄糖和果糖在夜間整體水平較低。本研究表明：毛竹莖稈在白天具有較高的可溶性糖和淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而在夜間則極顯著下降。可能是因?yàn)榘滋焐L(zhǎng)慢，可溶性糖利用少，不斷合成淀粉儲(chǔ)存在莖稈中，夜間生長(zhǎng)加快，可溶性糖消耗快，淀粉大量降解成可溶性糖為黑暗中繼續(xù)生長(zhǎng)提供能量[26]。推測(cè)毛竹快速生長(zhǎng)時(shí)期糖和淀粉代謝可能受到光周期和生物鐘調(diào)控[27]。LINGLE等[28]研究生長(zhǎng)期甘蔗Saccharum officinarum莖稈發(fā)現(xiàn)：蔗糖和總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)由下往上逐漸降低。翟建云等[29]研究毛竹莖稈碳水化合物代謝發(fā)現(xiàn)：自下而上淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐節(jié)上升，葡萄糖、果糖和蔗糖逐漸下降。本研究中，莖稈中下部節(jié)間可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)低，上部節(jié)間NSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平與中下部相反。可能是因?yàn)槊袂o稈中下部生長(zhǎng)速度快，淀粉大量轉(zhuǎn)化成可溶性糖為快速生長(zhǎng)提供碳源，莖稈上部生長(zhǎng)較慢，可溶性糖需求少，淀粉降解慢[30]，表明莖稈發(fā)育和成熟是從下往上順次推進(jìn)的[29]。

淀粉酶是淀粉水解反應(yīng)過(guò)程中的一種重要催化劑，酶活性的高低影響淀粉的降解速率[31]。PONGRATZ等[32]研究菠菜Spinaciaoleracea葉綠體發(fā)現(xiàn)：夜間淀粉酶活性比白天高。鄭德森[33]研究甘蔗Saccharumofficinarum葉片淀粉酶活性變化發(fā)現(xiàn)：BAM活性通常高于AMY。本研究中，莖稈中下部節(jié)間BAM活性比上部節(jié)間高。中下部生長(zhǎng)速度快，淀粉在BAM催化作用下大量降解為麥芽糖，此時(shí)麥芽糖酶活性較高，加速麥芽糖分解成單糖；上部生長(zhǎng)緩慢，淀粉利用較少，酶活性相應(yīng)較低。以上研究結(jié)果表明：毛竹莖稈內(nèi)AMY在淀粉降解中不起作用，BAM在毛竹莖稈內(nèi)淀粉轉(zhuǎn)化成可溶性糖的過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用[13,34]。

在莖稈生長(zhǎng)的不同時(shí)間、不同節(jié)間，淀粉酶基因表達(dá)量存在較大差異。HARMER等[35]研究擬南芥葉片發(fā)現(xiàn)：BAM具有晝夜生理周期變化。劉美等[15]研究發(fā)現(xiàn)：小麥Triticumaestivum種子萌發(fā)時(shí)AMY基因相對(duì)表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，且與酶活性呈極顯著相關(guān)。陽(yáng)江華等[36]研究發(fā)現(xiàn)：白天橡膠樹(shù)Hevea brasiliensisHbBAM1基因表達(dá)量顯著高于夜間。本研究中，PeAMY基因表達(dá)變化不顯著，PeBAM夜間表達(dá)量顯著高于白天，說(shuō)明PeBAM主要在夜間發(fā)揮其生物學(xué)功能。毛竹莖稈夜間生長(zhǎng)速度快，此時(shí)非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量低，PeBAM基因表達(dá)量高，PeBAM基因可能在夜間調(diào)控淀粉的降解。莖稈中下部節(jié)間PeBAM基因表達(dá)量比上部節(jié)間高，可能是因?yàn)榍o稈中下部節(jié)間生長(zhǎng)速度快，淀粉快速轉(zhuǎn)化成可溶性糖為快速生長(zhǎng)提供碳源，此時(shí)，PeBAM基因大量表達(dá)加速淀粉降解；上部生長(zhǎng)速度慢，可溶性糖利用較少，淀粉降解較少，基因表達(dá)量低。與酶活性變化趨勢(shì)相同，PeBAM基因表達(dá)與酶活性之間可能有密切聯(lián)系。LLOYD等[16]研究小麥淀粉降解過(guò)程發(fā)現(xiàn)：AMY在胚乳中過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致淀粉降解率升高，可溶性糖增加。MITA等[37]研究擬南芥蓮座葉發(fā)現(xiàn)：隨著可溶性糖含量升高，淀粉含量顯著增加，BAM基因轉(zhuǎn)錄水平和其活性都顯著提高。本研究中，PeBAM基因夜間表達(dá)量極顯著高于白天，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量也有明顯的晝夜變化規(guī)律，表明PeBAM的基因表達(dá)可能被糖信號(hào)所調(diào)控，從而在毛竹莖稈的快速生長(zhǎng)中起重要作用[38]。

綜上所述，毛竹在莖稈快速生長(zhǎng)期將白天光合作用形成的可溶性糖轉(zhuǎn)化成淀粉儲(chǔ)藏起來(lái)，生長(zhǎng)速度慢；夜間PeBAM基因表達(dá)增強(qiáng)使BAM活性上升，促進(jìn)淀粉快速轉(zhuǎn)化成可溶性糖提供碳源，生長(zhǎng)速度快。莖稈發(fā)育和成熟是從下往上順次推進(jìn)的，NSC質(zhì)量分?jǐn)?shù)和PeBAM基因表達(dá)在莖稈上部節(jié)間變化不顯著；中下部PeBAM基因表達(dá)達(dá)到最高，淀粉降解最快。表明毛竹莖稈快速生長(zhǎng)與PeBAM基因的表達(dá)密切相關(guān)，BAM在毛竹莖稈淀粉降解中可能起主要作用。