生命早期應激下肝調(diào)暢情志功能中樞改變探討＊

史亞飛，張 榮，曹可潤，郭麗麗，董釗揚

（1.廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院 廣州 510006；3.河南中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 鄭州 450000；4.廣州中醫(yī)藥大學護理學院 廣州 510006）

精神情志異常類疾病給現(xiàn)代社會帶來越來越沉重的負擔，從中醫(yī)肝主疏泄調(diào)暢情志功能入手可以對此類疾病給予很好的防治，并揭示其內(nèi)在的發(fā)病機制。但隨著研究的不斷深入，各項結(jié)果均顯示其癥狀的嚴重程度、預后等，除了跟生物致病因素有關外，更與眾多社會因素密切相關[1]。生命早期應激為肝主疏泄調(diào)暢情志功能研究及其對精神情志異常類疾病的防治提供了更全面的視角。情志功能改變不僅是即刻應激因素所導致的效應，也與早期應激負性因素與事件緊密相關[2]。這在現(xiàn)代社會 “親子長期分離、人際缺乏必要交流、長期負性壓力” 不良生活方式下所致的青少年認知障礙、社交障礙、情志異常等病證中尤為突出。更重要的是，早期應激的前期效應與成年后應激誘導的疊加可能是情志疾病發(fā)作與反復的重要原因。將兩者結(jié)合研究更加符合其生理病理發(fā)展過程，有助于進一步闡明發(fā)病機制。

基于 “方-證（模型）-效-功能本質(zhì)” 思路，從正常應激下的生理變化和病證狀態(tài)下的病理改變兩條途徑入手，肝調(diào)暢情志中樞功能研究已取得較為一致的初步結(jié)果[3-5]。在此基礎上，本課題組立足早期應激這一重要因素，結(jié)合中醫(yī)生命早期 “肝常有余” 生理特性開展探索性研究[6]，助力肝調(diào)暢情志功能中樞機制研究的深入。現(xiàn)試探討之。

1 新的研究切入點

1.1 聚焦多因素病因

研究重點關注早期應激效應及其與成年后應激的相互作用。目前對情志異常病因較為一致的現(xiàn)代認識是遺傳因素、生命早期負性應激及成年后的環(huán)境因素的相互作用[7]。早期應激是指在生命早期如母孕期、兒童期、青少期等受到的超出自身承受能力的生理心理創(chuàng)傷[8]。伴隨現(xiàn)代生活方式的轉(zhuǎn)變，早期應激已成為情志發(fā)病的重要因素。主要是基于：生命早期是神經(jīng)元生長及突觸形成的關鍵階段，廣泛涉及中樞神經(jīng)突觸重塑。除本身的負性作用外，早期應激還會對大腦發(fā)育、行為、學習記憶形成過程產(chǎn)生長期的影響，神經(jīng)生長重塑改變，進而誘導成年后的情志與認知障礙[9,10]。從中醫(yī)病機來看，生命早期 “神” “形” 同步發(fā)展，是人體臟腑功能與心身發(fā)育的關鍵時期，易受外界侵擾，并遷延或影響至成年。特別青少期是向成年期過渡的重要時期，生理變化大，社會接觸多，或家長過度溺愛、或缺乏關愛，所欲不遂，極易發(fā)生情志改變，并影響至成年[11]。因此，生命早期不良情志改變及其對成年后的影響應該成為肝調(diào)暢情志功能研究的重要內(nèi)容。

1.2 強化證候狀態(tài)模擬

生命早期 “肝常有余” 生理特性有助于情志內(nèi)傷肝病證過程構(gòu)建。從五臟功能而言，小兒多 “肺氣嬌嫩，脾常不足，腎常虛，心常用余、肝常用余” 。特別是青少期， “肝常有余” 指機體秉少陽生發(fā)之氣，如草木初萌，生機蓬勃，發(fā)育迅速；肝氣升發(fā)則五臟俱榮，肝失升發(fā)則五臟虛衰；病理上 “小兒易怒，肝病最多” ，受外界刺激，肝喜條達之性被扼，出現(xiàn)郁怒、煩躁、抑郁等表現(xiàn)，生理上的有余轉(zhuǎn)化為病理上的亢盛。因此，肝調(diào)暢情志在青少年心身發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[12]。從現(xiàn)代研究來看，隨著醫(yī)學模式轉(zhuǎn)變，與軀體性疾病相比，青少期心理情志異常呈大幅上升趨勢，且青少期情志異常90%以上多是多種心理行為疾病共病[13]，郁怒、煩躁、焦慮、抑郁等交雜出現(xiàn)，提示生命早期（青少期）情志內(nèi)傷病理狀態(tài)是多證候共同存在的狀態(tài)。此狀態(tài)可以更加體現(xiàn)出長期情志內(nèi)傷所致的肝失疏泄病證過程中交雜存在的 “肝氣郁結(jié)” “肝火上炎” “肝陽上亢” 等多證候狀態(tài)，體現(xiàn)慢性應激狀態(tài)下情志內(nèi)傷肝病證的綜合改變過程，有助于基礎實驗研究的開展。基于生理發(fā)展和病證改變多個角度，從生命早期（青少期）慢性應激反應入手，有助于肝失疏泄證候變化的研究和青少期情志異常證治機理的闡明。

1.3 重視病證動態(tài)觀測

5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）系統(tǒng)可作為關鍵腦區(qū)同一通路的持續(xù)觀測靶點。動態(tài)觀測變化是科學評價中醫(yī)病證的必由之路徑，也是當前腦中樞機制研究的發(fā)展趨勢。由于生長發(fā)育過程中神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的不穩(wěn)定變化，動態(tài)觀測中樞調(diào)控關鍵腦區(qū)變化，同步開展早期應激及其與成年后誘導相結(jié)合的累積效應分析成為難點，必須尋求一個穩(wěn)定的作用通路。5-HT系統(tǒng)或可成為這一目標的最佳靶點或生物學標記物。其一，在神經(jīng)元生長及突觸形成的青少期階段，5-HT系統(tǒng)即已達到成熟且穩(wěn)定維持至成年，可以為青少期及成年后兩個時期比較性研究提供同一通路靶點（其他通路仍多處于變化當中）[14,15]。其二，5-HT系統(tǒng)一直是調(diào)肝治法方藥干預情志異常疾病的較為肯定的主要通路之一，結(jié)合現(xiàn)有早期應激相關研究提示：①5-HT系統(tǒng)在早期應激作用下可能在青少期即已改變，并影響至成年；②青少期應激效應及其誘發(fā)的抑郁等主要由5-HT系統(tǒng)介導，調(diào)肝治法方藥（四逆散及其加味）可以有效進行調(diào)控[16，17，18]。從青少期和成年期兩階段、多時間節(jié)點入手，以5-HT及其相關信號傳導通路改變?yōu)橹饕^測指標，為動態(tài)觀測肝調(diào)暢情志病證中樞變化提供了新思路。

2 初步的一些研究結(jié)果

綜上所述，病因上從生命早期慢性應激因素入手，病機病理上充分結(jié)合生命早期（青少期） “肝常有余” 生理特性，以5-HT及其相關信號傳導通路改變?yōu)橹饕^測指標，動態(tài)觀測肝調(diào)暢情志中樞調(diào)控關鍵腦區(qū)變化，分析生命早期應激因素及其與成年后環(huán)境應激誘導相結(jié)合的協(xié)同與累積效應，應成為肝調(diào)暢情志功能中樞機制研究的新領域。開展相應的實驗研究有助于該論點論據(jù)的證實。

2.1 假說的提出

生命早期應激是導致肝調(diào)暢情志功能變化的重要病因，情志內(nèi)傷肝失疏泄病證過程又在生命早期應激狀態(tài)下得到更好地體現(xiàn)。基于兩者的緊密關聯(lián)性，病證結(jié)合開展生命早期應激反應狀態(tài)下的肝失疏泄情志失調(diào)功能機制研究是一個新的較好途徑。針對生命早期神經(jīng)元生長及突觸形成特點，結(jié)合5-HT系統(tǒng)早成熟、早穩(wěn)定性，早期（特別是青少期）應激狀態(tài)下5-HT系統(tǒng)改變可作為觀測肝主疏泄調(diào)暢情志功能變化的核心靶點與通路，其所在核團中縫背核的功能改變、5-HT突觸可塑性改變、及5-HT的異常釋放可能是肝失疏泄及其病證（抑郁等）中樞改變的重要病理生理基礎。中縫背核突觸前膜5-羥色胺轉(zhuǎn)運體（5-hydroxytryptamine transporter，5-HTT）重攝取、5-HT1AR的負反饋及鈣敏感受體（Calcium-sensing receptor，CaSR）等介導的信號通路，可作為核心觀測指標和調(diào)肝治法方藥作用機制研究的關鍵靶點。同時，為觀測生命早期應激因素與成年后應激的協(xié)同與累積效應，動態(tài)檢測應激狀態(tài)下不同時段的5-HT系統(tǒng)變化，亦是必須開展的重要研究工作。

動物模型復制上，采用母嬰（子）分離模型（Maternal separation，MS）和慢性不可預知（計）性心理應激模型（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）模擬生命早期應激負性事件對青少期及成年后情志異常發(fā)病的影響。CUMS是主要模擬慢性抑郁狀態(tài)的經(jīng)典模型，通過傾斜籠具、潮濕墊料、合籠、熱水游泳等溫和刺激因子造模。母嬰（子）分離模型是探討早期負性應激事件相關的子代及其成年后精神障礙與心身疾病發(fā)病機制的經(jīng)典模型，通過剝奪模擬新生子代動物的早期生活環(huán)境來觀察其行為及神經(jīng)發(fā)生發(fā)育改變[19]。

2.2 初步的實驗發(fā)現(xiàn)

2.2.1 模型復制與評價

青少年期在人類生命周期中為13歲-18歲，對于大鼠來講大致為出生后28天-60天[20]。單純采用CUMS制作青少期（32天-60天）應激動物模型，結(jié)果表明60天青少期大鼠應激造模后體重增長緩慢，糖水偏愛指數(shù)顯著降低，促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocortico-tropic-hormone，ACTH）和皮質(zhì)酮（Corticosterone，CORT）含量顯著升高，對照CUMS行為學及激素水平等指標的基本變化，提示青少年期應激模型制備成功。曠場測試是檢測大鼠抑郁焦慮行為的經(jīng)典指標之一。結(jié)果顯示模型大鼠中央?yún)^(qū)活動時間有所延長，提示應激后模型大鼠對新環(huán)境的認知能力相對較差[18]。

本課題組對首次運用的母嬰分離應激模型大鼠行為學等進行了系統(tǒng)觀察。實驗采用1日齡SD大鼠，隨機設置母嬰分離（MS）組和空白組，雌雄各半。分別于56天、58天、60天、67天、74天進行曠場、糖水偏愛、高架Zero迷宮、強迫游泳等行為學實驗檢測。結(jié)果顯示，經(jīng)歷哺乳期（1天-21天）MS應激雄性大鼠22天-52天的體重增長量顯著低于正常飼養(yǎng)的大鼠，雌性組有增長變緩趨勢但無統(tǒng)計學差異。在行為學的評估中，研究采取較為經(jīng)典的快感缺失和行為絕望評價指標。結(jié)果顯示，雌雄模型大鼠的糖水偏愛度均顯著降低。強迫游泳實驗中，雄性MS大鼠的漂浮不動時間高于正常大鼠。曠場實驗結(jié)果顯示，在雌性大鼠中不具有統(tǒng)計學意義，而雄性MS大鼠的活躍度顯著低于正常大鼠。高架Zero迷宮檢測中，雄性模型大鼠進入開臂的次數(shù)百分比明顯低于空白組，雌性模型大鼠百分比均明顯低于空白組。各項數(shù)據(jù)顯示：經(jīng)歷21天母嬰分離應激的雌雄大鼠，在青少期均出現(xiàn)了抑郁樣行為，并伴隨一定程度的焦慮樣行為[21]。

在早期應激及其與成年后應激誘導相互作用的復合模型實驗中采取了多種方式。一是兒童期青少期內(nèi)復合應激，如在兒童期（1天-21天）母子分離后再進行青少期（24天-51天）CUMS造模，觀察51天青少期應激大鼠狀態(tài)[22]；二是青少期與成年期應激的聯(lián)合采用，如在青少期（21天-44天）與成年期（57天-78天）分段運用CUMS制備方式，并選擇44天、56天、78天三個時間點作為青少年期、成年期、成年后三個年齡階段的觀察點[23]；或在兒童期（1天-21天）母子分離后再進行成年期（60天-100天）CUMS造模，觀察100天成年期應激大鼠狀態(tài)，來模擬不同情況下的青少期和成年期復合應激抑郁大鼠狀態(tài)[24]。以上模型在體重增長、糖水偏愛指數(shù)、行為學等方面亦顯示出相似結(jié)果。

2.2.2 調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（Hypothalamuspituitary-adrenal，HPA）軸

HPA軸改變是慢性心理應激反應神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的基本改變。60天時青少期應激模型大鼠血漿ACTH和CORT含量均明顯上升，表明慢性應激狀態(tài)下的青少期大鼠HPA軸處于亢進狀態(tài)；經(jīng)過治療后的模型大鼠血漿ACTH和血清CORT含量均明顯下降，提示調(diào)肝經(jīng)典方藥（四逆散及其加味）可以顯著改善模型大鼠的應激狀態(tài)[18]。在母子分離（1天-21天）和CUMS（24天-51天）青少期復合應激抑郁大鼠模型中，顯示出相似結(jié)果[22]。

2.2.3 對中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

海馬和前額葉皮質(zhì)是調(diào)節(jié)情緒的重要腦區(qū)。研究顯示，56天應激大鼠海馬及前額葉皮質(zhì)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）、多巴胺（Dopamine，DA）、5-HT含量均顯著下降，提示CUMS青少期應激大鼠抑郁樣行為與相關腦區(qū)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)表達降低有關[16]。在母嬰分離（21天-28天）和CUMS（29天-56天）復合應激模型中，大鼠腦中樞海馬及前額葉皮質(zhì)部位5-HT及5-羥吲哚乙酸含量均較母嬰分離模型大鼠進一步降低，雌性大鼠和雄性大鼠之間無統(tǒng)計學差異，提示經(jīng)母嬰分離后，再次受到青少期慢性二次應激會加重中樞海馬及前額葉部位的神經(jīng)元功能損傷，從而加重抑郁樣行為；未發(fā)現(xiàn)性別之間有差異。加味四逆散組大鼠可提高大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的表達[25]。

2.2.4 對中樞5-HT通路的影響及不同階段的動態(tài)觀察

采取CUMS模型，青少期（21天-44天）與成年期（57天-78天）造模及給藥，選擇44天、56天、78天3個時間點作為青少年期、成年期、成年后三個年齡階段的動態(tài)觀察點。結(jié)果顯示：青少期模型大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列松散，鏡下較多神經(jīng)元萎縮；成年期與成年后組鏡下則可見較多神經(jīng)元萎縮，局部區(qū)域神經(jīng)元缺失且小膠質(zhì)細胞增生，提示CUMS應激可引起中樞海馬的結(jié)構(gòu)及功能呈進行性損傷。與同階段模型組相比，加味四逆散治療組神經(jīng)元萎縮與深染減少，提示調(diào)肝方藥有一定干預作用[23]。

5-HTT、5-HT1A受 體（Serotonin 1A receptor，5-HT1AR）是反映5-HT能神經(jīng)元功能活動的重要指標。結(jié)果表明，按照生命成長時間順序，青少年期、成年期、成年后各組空白組大鼠中樞海馬CA1區(qū)5-HTT平均光密度值呈上升趨勢，而造模后成年期、成年后顯著降低；與模型組對比，加味四逆散組結(jié)果有升高趨勢。各組大鼠海馬CA1區(qū)5-HT1AR平均光密度值組內(nèi)比較，青少期與成年后組模型組有顯著降低；加味四逆散組有上升趨勢。提示，CUMS導致青少期大鼠產(chǎn)生抑郁樣行為，在成年后階段繼續(xù)施加負性不可預計性刺激會將會進一步加重抑郁狀態(tài)，海馬內(nèi)5-HTT、5-HT1AR改變可能是重要通路。復合模型中于幼年期組（28天）、青少期組（42天）、成年期組（56天）取材，免疫組化實驗檢測原位5-HT1AR表達，檢測各組大鼠中樞海馬的5-HT1AR、環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白（Cyclic adenosine effector element-binding protein，CREB）、磷酸化cAMP依賴蛋白激酶（Phosphorylated protein kinase A，p-PKA）底物蛋白和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）蛋白表達，結(jié)果顯示早期經(jīng)歷母嬰分離應激的大鼠海馬內(nèi)5-HT1AR/CREB/BDNF信號通路蛋白分別在幼年期、青少期和成年期表現(xiàn)出不同程度的下調(diào)[26]。

2.2.5 四逆散及其加味的干預作用

以方測證，回歸經(jīng)典，采用臨床上用于情志疾病治療的常用基礎方——四逆散（柴胡、芍藥、枳實、甘草）以及加味方。其中，柴胡疏肝解郁，順應肝升發(fā)條達之性；枳實助柴胡疏肝行氣理脾；白芍清熱滋陰養(yǎng)血柔肝，兼防肝郁化火；甘草，調(diào)和諸藥。整個方劑組成根據(jù)青少期應激反應過程的實際病理變化， “解郁” 為主，疏肝、柔肝、平肝及清肝有機并用。在上述系列實驗中，以四逆散及其加味為代表方劑的調(diào)肝治法方藥可以有效干預MS、CUMS及其復合應激大鼠模型的抑郁樣行為與癥狀。作用通路與上調(diào)5-HT1AR/CREB/BDNF信號等多個通路有關。而且對復方辨證治療抑郁癥的高頻中藥數(shù)據(jù)研究表明，柴胡、白芍、甘草均是治療抑郁癥的高頻藥物[27]。

2.3 一些初步的結(jié)論

2.3.1 成功模擬生命早期應激及復合應激下的肝失疏泄情志內(nèi)傷狀態(tài)

生命早期應激是導致青少期情志異常的重要因素，并對成年后情志異常的發(fā)生與反復產(chǎn)生重要影響。早期應激狀態(tài)下情志內(nèi)傷肝失疏泄病證得到更好體現(xiàn)。 “四逆散-生命早期應激（母子分離）模型-5-HT能系統(tǒng)-中縫背核腦區(qū)-肝調(diào)暢情志功能” 這一方-證（模型）-效-功能本質(zhì)研究思路得到確立。

2.3.2 初步闡明早期應激狀態(tài)下情志內(nèi)傷肝失疏泄病證改變，豐富并完善四逆散抗抑郁藥效研究。

早期應激下肝調(diào)暢情志功能中樞改變與各部位（中縫背核、海馬和前額葉皮質(zhì)）單胺類神經(jīng)遞質(zhì)相關，尤以5-HT、5-HT1AR含量改變密切。不同劑量四逆散及其加味對模型大鼠產(chǎn)生作用，顯示調(diào)肝方藥可以顯著改善生命早期（青少期）應激大鼠的抑郁樣表現(xiàn)，可能通過上調(diào)海馬5-HT1AR-CREB-BDNF信號通路發(fā)揮抗抑郁作用，并與中縫背核5-HT1AR、5-HTT、CaSR、BDNF等蛋白表達有關。

3 未來研究的思考

3.1 病因與病理階段的拓展

生命早期包括母孕期、兒童期、青少期等各階段，事實上各階段之間存在著密切的聯(lián)系與影響。近年來許多中醫(yī)藥學者開展的研究均涉及到以上各個階段[28，29，30]。特別是魏盛等提出 “七情伏邪學說” 是在理論上對青少期負性事件對后期情志異常發(fā)病機制影響的一個創(chuàng)新[30]。結(jié)果證實，母孕期刺激后，父代與子代之間的影響，子代中兒童期、青少期以及對成年期之間的影響，都是非常有價值的研究命題。應當繼續(xù)研究下去。

3.2 進一步推進青少期與成年期抑郁之間的比較性研究

兩者在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)改變和藥物干預效果等方面既存在不同，但也有重要的聯(lián)系與協(xié)同作用。生命早期應激病因方式可成為不同年齡階段之間的重要研究通道。必須關注生命早期應激因素在精神障礙類或情志異常疾病機制研究中的重要作用，并運用其作為動態(tài)觀察肝失疏泄情志失調(diào)病證變化的載體。中縫背核5-HT能系統(tǒng)可成為兩者比較性研究的效能觀測指標。

3.3 嘗試推動肝失疏泄情志失調(diào)病證變化的動態(tài)觀測

整體審察、病證結(jié)合、辯證論治是中醫(yī)診治的核心內(nèi)容，因此開展證候研究必然要進行動態(tài)觀測變化。肝失疏泄情志失調(diào)病因病機具有明顯的持續(xù)性與累積性，結(jié)合心理變化過程，必然使肝失疏泄病證是一個長期形成、動態(tài)變化與的過程。在前期大量的成年期情失內(nèi)傷肝失疏泄病證變化研究結(jié)果上，將生命早期包括母孕期、兒童期、青少期等各階段納入，開展全過程研究，將使肝調(diào)暢情志功能與病證規(guī)律研究邁上新臺階。結(jié)合當前腦核團功能神經(jīng)影像學研究的不斷深入，肝調(diào)暢情志功能中樞改變亦會越來越明晰[31]。