薄荷-荊芥穗揮發油羥丙基-β-環糊精包合物的制備

王 琪胡佳亮張金良郭 寧吳 飛 林 曉*康興東*馮 怡

(1.上海中醫藥大學中藥學院,上海 201203;2.上海中醫藥大學中藥現代制劑技術教育部工程研究中心,上海 201203;3.江西普正制藥股份有限公司,江西 吉安 343100)

薄荷為唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分,具有疏散風熱、清利頭目等作用；荊芥穗為唇形科植物荊芥 Schizonepeta tenuisfolia Briq.的干燥花穗,具有解表散風、透疹等作用,在辛涼解表制劑中常將兩者混合后提取揮發油,是發揮相關療效的重要物質基礎[1]。其中,薄荷揮發油主要成分為薄荷腦、L-薄荷酮,而荊芥穗揮發油主要由胡薄荷酮、L-薄荷酮等成分組成。

大多數揮發油具有不穩定、易揮發、刺激性強等特點,為了提高該成分在液體制劑中的穩定性,常采用β-環糊精、羥丙基-β-環糊精對其進行處理[2-3]。本實驗制備了薄荷-荊芥穗揮發油羥丙基-β-環糊精包合物,并優化了其包合工藝[4],以期為該制劑研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 XP205 型電子分析天平(0.01 mg,瑞士Mettler-Toledo 公司)；FA2104N 型電子分析天平(0.1 mg,上海精密科學儀器有限公司)；Labconco 12 Plus Free Zone 型冷凍干燥機(美國Labconco 公司)；SHJ-6AB 型磁力攪拌水浴鍋(常州金壇良友儀器有限公司)；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；TGL-18C 型臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；Aglient 7890A型氣相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；UPR-I-10T 型純化水制備儀(成都超純科技有限公司)；玻璃儀器(上海青陽生物科技有限公司)。

1.2 試劑與藥物 薄荷腦(批號110728-201707,純度99.8%)、L-薄荷酮(批號111705-201105,純度99.8%)、胡薄荷酮(批號111706-201606,純度99.8%) 對照品(中國食品藥品檢定研究院)；羥丙基-β-環糊精(批號180101,淄博千匯生物科技有限公司)。薄荷-荊芥穗揮發油(批號190304,薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮質量分數分別為38%、18%、17%,江西普正制藥股份有限公司)。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 包合物制備 參考文獻[5-7]報道。精密稱取一定量羥丙基-β-環糊精,加適量水,在60 ℃下溶解后冷卻至所需溫度,吸取少量揮發油,無水乙醇稀釋后緩慢滴到羥丙基-β-環糊精溶液中,恒溫下磁力攪拌一定時間,冷凍干燥,少量乙酸乙酯洗滌,40 ℃下烘干,即得。

2.2 揮發油含有量測定

2.2.1 色譜條件 參考文獻[8]報道。HP-5 型高效毛細管色譜柱(0.32 mm×30 m,0.25 μm)；載氣N2,體積流量1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；程序升溫,60 ℃下保持1 min,3 ℃/min 升至126 ℃,26 ℃/min 升至230 ℃,保持2 min；FID檢測器溫度280 ℃；進樣量0.20 μL,不分流進樣。色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮對照品適量,置于量瓶中,甲醇溶解稀釋,即得(0.10 mg/mL,3 種成分質量濃度分別為0.100 2、0.102 3、0.098 6 mg/mL)。

圖1 各成分GC 色譜圖Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱取干燥包合物200 mg,置于錐形瓶中,加入50 mL 乙醇,稱定質量,超聲處理20 min,放冷,乙醇補足減失的質量,搖勻,12 000 r/min 離心10 min,取上清液,即得。

2.2.4 方法學考察

2.2.4.1 線性關系考察 分別取對照品薄荷腦50.20 mg、L-薄荷酮51.25 mg、胡薄荷酮49.40 mg,置于5 mL 量瓶中,甲醇定容至刻度,分別制成10.00 mg/mL 溶液,甲醇依次稀釋至5.00、2.50、1.00、0.10、0.05、0.01 mg/mL,各精密吸取0.2 μL,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)進行回歸,得薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮方程分別為Y=9 398.4X-86.048 (r=0.999 6)、Y=9 138.9X-93.553 (r=0.999 6)、Y=8 038.8X-73.495(r=0.999 6),分別在0.01～10.04、0.01～10.25、0.01～9.88 mg/mL 范圍內線性關系良好。

2.2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.2” 項下對照品溶液適量,在“2.2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次,每次0.2 μL,測得薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮峰面積RSD 分別為1.75%、1.86%、1.79%,表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 穩定性試驗 精密吸取“2.2.3” 項下同一份供試品溶液適量,于0、2、4、6、8、12 h在“2.2.1” 項色譜條件下各進樣0.2 μL 測定,測得薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮峰面積RSD 分別為1.76%,1.81%、1.82%,表明溶液在12 h 內穩定性良好。

2.2.4.4 重復性試驗 取6 份包合物,每份約200 mg,按“2.2.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.2.1” 項色譜條件下各進樣0.2 μL 測定,測得薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮峰面積RSD 分別為1.68%、1.28%、1.48%,表明該方法重復性良好。

2.3 包合率、含油率、收率測定 指標性成分薄荷腦-L-薄荷酮-胡薄合酮(1∶1∶1) 包合譯價的計算公式分別為包合率=包合物實際含油量/揮發油加入量×100%、含油率=包合物實際含油量/包合物質量×100%、收率=[包合物質量/ (羥丙基-β-環糊精加入量+揮發油加入量) ]×100%[9]。

2.4 綜合評分計算 以包合率 (Y1)、含油率(Y2)、收率(Y3) 的綜合評分為評價指標[10],采用G1主觀賦權法對原始數據進行處理[11-12],上述3 種指標分別賦予權重系數0.5、0.3、0.2[13],計算綜合評分(Y),公式為Y=(Y1/Y1max) ×0.5+(Y2/Y2max) ×0.3+(Y3/Y3max) ×0.2。

2.5 單因素試驗 查閱文獻[14-16],本實驗選擇羥丙基-β-環糊精與揮發油比例、羥丙基-β-環糊精質量分數、包合溫度、包合時間、攪拌速度作為影響因素,因素水平見表1,結果見圖2～6。由此可知,羥丙基-β-環糊精與揮發油比例對包合效果有顯著影響(P＜0.05),最優工藝暫定為羥丙基-β-環糊精與揮發油比例12∶1,羥丙基-β-環糊精質量分數40%,包合溫度40 ℃,包合時間1.5 h,攪拌速度600 r/min。

表1 單因素試驗因素水平Tab.1 Factors and levels for single factor tests

2.6 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗基礎上,選擇羥丙基-β-環糊精與揮發油比例(A)、羥丙基-β-環糊精質量分數(B)、包合溫度(C) 作為影響因素,含油率、包合率、收率的綜合評分(Y) 作為評價指標,Box-Behnken 響應面法優化包合工藝[17]。因素水平見表2,結果見表3。

圖2 羥丙基-β-環糊精與揮發油比例對綜合評分的影響Fig.2 Effect of （hydroxypropyl-β-cyclodextrin） -volatile oils ratio on comprehensive score

圖3 羥丙基-β-環糊精質量分數對綜合評分的影響Fig.3 Effect of hydroxypropyl-β-cyclodextrin mass fraction on comprehensive score

圖4 包合溫度對綜合評分的影響Fig.4 Effect of inclusion temperature on comprehensive score

圖5 包合時間對綜合評分的影響Fig.5 Effect of inclusion time on comprehensive score

通過Design-Expert 8.0.6 軟件對表3 數據進行二項式擬合,得到方程為Y=81.24+10.99A-19.43A2(r=0.835 6),方差分析見表4。由此可知,模型P＜0.05,失擬項P＞0.05,表明模型擬合度良好；各因素影響程度依次為A＞B＞C,其中A有顯著影響(P＜0.05),而B、C 無顯著影響(P＞0.05)。

圖6 攪拌速度對綜合評分的影響Fig.6 Effect of stirring speed on comprehensive score

表2 Box-Behnken 響應面法因素水平Tab.2 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表3 試驗設計與結果Tab.3 Design and results of tests

通過Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面分析,結果見圖7～10。由此可知,在試驗參數范圍內隨著羥丙基-β-環糊精與揮發油比例增加,含油率逐漸降低,包合率逐漸升高,收率有升高趨勢但不如包合率明顯,最終達到相對穩定的水平。最終確定,最優工藝為羥丙基-β-環糊精與揮發油比例11∶1,羥丙基-β-環糊精質量分數43%,包合溫度47 ℃,包合時間1.5 h,攪拌速度600 r/min,綜合評分為83.24,同時為便于工業化生產,將羥丙基-β-環糊精質量分數修正為40%。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

再按照優化工藝進行3 批驗證試驗,結果見表5,可知綜合評分平均值82.33 與預測值83.24 接近,表明該工藝穩定可行。

表5 驗證試驗結果（n=3）Tab.5 Results of verification tests （n=3）

3 討論

圖7 各因素對含油率的影響Fig.7 Effects of various factors on oil content

圖8 各因素對包合率的影響Fig.8 Effects of various factors on encapsulation efficiency

圖9 各因素對收率的影響Fig.9 Effects of various factors on yield

圖10 各因素對綜合評分的影響Fig.10 Effects of various factors on comprehensive score

Box-Behnken 響應面法的優勢在于通過建立多項式回歸模型對數據進行分析,能探究2 個因素之間交互關系對結果的影響,進一步補足單因素試驗缺陷,從而更為準確地預測最優方案[18],并且該方法突破了均勻設計、正交設計受線性模型限制的缺陷,具有試驗次數少、預測準確性高等優點[19]。因此,本實驗采用該方法優化薄荷-荊芥穗揮發油羥丙基-β-環糊精包合物制備工藝,得到最優條件為羥丙基-β-環糊精與揮發油比例11∶1,羥丙基-β-環糊精質量分數40%,包合溫度47 ℃,包合時間1.5 h,攪拌速度600 r/min,驗證試驗顯示該工藝穩定可行。

采用環糊精包合技術對揮發油進行包合后,能有效提高后者在液體制劑中的穩定性、溶解度,而且操作簡便可行,安全性高,但該方法受客體分子結構的影響較大,易造成包合前后揮發油成分發生變化[20-21]。因此,本實驗又同時測定了薄荷-荊芥穗揮發油中薄荷腦、L-薄荷酮、胡薄荷酮3 個指標成分的含有量,并以揮發油包合率、包合物含油率、收率的綜合評分為評價指標,以期篩選最佳包合工藝[22]。

另外,環糊精包合揮發油后自組裝效應會進一步加強,可能導致中藥液體制劑出現沉淀、澄明度變化等問題[23],從而影響其質量。因此,在包合過程中應適當降低環糊精的用量。