鵝不食草中抗肺癌活性成分篩選及異戊酸心菊內酯單體的體外作用研究

胡 倩 薛鵬輝于 弘王 敏趙新春邱 峰周光飚*

(1.北京中醫藥大學中藥學院,北京 102488;2.國家癌癥中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院分子腫瘤學國家重點實驗室,北京 100021;3.中國科學院動物研究所膜生物學國家重點實驗室,北京 100101;4.天津中醫藥大學中藥學院,天津 301617)

鵝不食草Centipeda minima (L.) A.Br.et Aschers.是菊科植物,分布廣泛,藥用歷史悠久,為常用中藥材,其氣微香,久嗅有刺激感,味苦、微辛,性溫,歸肺經,具有發散風寒、通鼻竅、止咳功效,適用于風寒頭痛、咳嗽痰多、鼻塞不通、鼻淵流涕等癥狀,具有抗炎、抗菌、抗過敏、神經保護作用[1-5]。課題組前期報道了鵝不食草單體的抗癌作用[6],并首次發現從中提取的化合物6-氧-當歸酰多梗白菜菊素在細胞、動物模型均顯示顯著的抗肺癌活性,其機理是和蛋白泛素連接酶E3 復合物(Skp1-Cullins-F-box E3,SCF E3) 的基本成分細胞周期S 期激酶相關蛋白1 (S-phase kinase associated protein,Skp1) 及具有促癌活性的信號傳導與轉錄激活因子3 (signal transduction and activators of transcription 3,STAT3) 結合,導致促癌性E3連接酶間變性淋巴瘤激酶核相互作用伴侶(nuclear-interacting partner of anaplastic lymphoma kinase,NIPA)、S 期激酶相關蛋白2 (S-phase kinase associated protein 2,Skp2)、β-轉導重復相容蛋白 (beta transducinrepeats containingproteins,β-TRCP) 從Skp1 解離而降解失活,而STAT3 活性受抑制使Skp2 活性進一步受抑制,引起肺癌細胞周期阻滯在有絲分裂期[7-8]。為了解鵝不食草是否還含有其他活性較強的抗肺癌物質,本實驗體外檢測了32 個單體化合物抗肺癌細胞活性,以期為該藥材相關作用的進一步開發奠定基礎。

1 材料

1.1 試劑與藥物 32 種鵝不食草單體化合物(CM-1～CM-32) 由天津中醫藥大學邱峰教授實驗室提供,純度均達99%以上。RPMI-1640、DMEM培養基購自美國Gilbco 公司；胎牛血清購自美國Hyclone 公 司；噻唑藍 [3-(4,5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT]、二甲基亞砜 (DMSO) 購自美國Amresco 公司；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；抗Cleaved caspase-3、caspase-8、PARP、ERK、p-ERK(Thr202/Tyr204)、AKT、p-AKT (Ser473)、NFκB 抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司；抗β-Actin 抗體、脫脂奶粉均購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.2 儀器 酶標儀(美國BioTek 公司)；倒置相差熒光顯微鏡(日本Olympus 公司)；CO2細胞培養箱(美國Thermo Scientific 公司)；流式細胞儀(美國BD 公司)；蛋白電泳儀及濕式蛋白電轉系統(上海天能科技有限公司)；脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.3 細胞 肺癌細胞均購自美國ATCC 細胞庫,在37 ℃、含5% CO2的恒溫細胞培養箱中培養。其中,A549 用加入10%胎牛血清的DMEM 培養基培 養,NCI-H1975、NCI-H1299、NCI-H460、NCIH520 用加入10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養基培養。

2 方法

2.1 化合物配制 32 種鵝不食草單體化合物均溶于DMSO,配成濃度為20 mmol/L 的母液,保存于-20 ℃。使用時稀釋并加入到細胞培養基,調整至化合物終濃度為1～20 μmol/L。

2.2 MTT 法檢測細胞存活率 取對數生長期細胞,胰酶消化細胞計數后,調整細胞密度至5×104個/mL,用96 孔板鋪板,每孔加入100 μL 細胞懸液；待細胞完全貼壁后換上含有相應藥物濃度梯度的新鮮培養基,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h。測前3 h 加10 μL MTT 溶液,用酶標儀測定570 nm 波長處吸光度值并計算細胞存活率及半數抑制濃度(IC50)[9]。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 消化要檢測的細胞(每個樣品約1.5×105個細胞),PBS 洗2 遍,每次用1 000 g 離心5 min 后去上清,收集細胞,加入195 μL Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞,每個樣品加入3 μL FITC-Annexin V 染料輕輕混勻,室溫避光孵育10～20 min,隨后置于冰浴上,孵育過程中可以重懸細胞2～3 次以改善染色效果。上機前加入5 μL 溴化乙啶染料,通過流式細胞儀檢測凋亡的肺癌細胞比例。

2.4 免疫印跡 取等量蛋白樣品于12% SDSPAGE 膠上樣,先80 V 恒壓電泳15 min,待樣品跑至分離膠再將電泳電壓調高至120 V,待樣品遷移到目的位置后,結束電泳。濕法轉膜后,加入含5% 脫脂奶粉的TBS-T 液體中室溫封閉1 h。按1∶1 000的比例加入一抗稀釋液,室溫孵育3 h,4 ℃過夜。第2 天,孵育二抗、洗膜、顯影。

3 結果

3.1 32 個鵝不食草單體化合物對肺癌細胞系的抑制作用 用濃度為20 μmol/L 的32 種鵝不食草單體化合物(CM-1～CM-32) 分別處理非小細胞肺癌細胞株H460、A549,48 h 后行MTT 實驗分析其對肺癌細胞增殖的抑制作用。在32 種鵝不食草單體中有10 種(31.3%) 能使這2 種細胞株的增殖活性減少15%以上,它們分別是CM-5、CM-6、CM-8、CM-13、CM-16、CM-19 (阿里二醇)、CM-20、CM-25 (6-氧-當歸酰多梗白菜菊素)、CM-26 (異戊酸心菊內酯)、CM-28 (圖1、表1)。

圖1 32 種鵝不食草單體成分對肺癌細胞增殖活性的影響（，n=3）Fig.1 Effects of thirty-two compounds on lung cancer cell viability （，n=3）

3.2 抗肺癌活性較強的化合物 3 個化合物阿里二醇、6-氧-當歸酰多梗白菜菊素、異戊酸心菊內酯在20 μmol/L 的濃度下對A549、H460 細胞系具有顯著的抑制作用,對細胞增殖活性的抑制率達到70%以上(圖1)。于是進一步研究了這3 個化合物的抗肺癌作用。在不同濃度梯度下,這3 個化合物對 5 種肺癌 細胞株 H460、A549、H1975、H1299、H520 的增殖均表現出較強的抑制作用,且呈劑量依賴性,IC50均為μmol/L 級,而6-氧-當歸酰多梗白菜菊素、異戊酸心菊內酯的作用較強,對H460、A549、H1975、H1299 細胞株的IC50在2.74～8.59 μmol/L 之間,而對H520 的IC50分別為11.68、20.66 μmol/L (表2)。

3.3 異戊酸心菊內酯對H1975、H1299 細胞的凋亡誘導作用 由于異戊酸心菊內酯具有較強的抑制肺癌細胞增殖的作用(表2),于是進一步研究其凋亡誘導作用。用濃度為5、7.5 μmol/L 的異戊酸心菊內酯處理H1975 細胞48 h,可使60%和80%的細胞發生凋亡 (圖2)。用濃度為2.5、5、7.5 μmol/L的異戊酸心菊內酯同樣處理H1299 細胞,發生凋亡的細胞比例分別為15%、66.5%、84% (圖3)。

3.4 異戊酸心菊內酯對凋亡蛋白的影響 半胱氨酸蛋白酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase) 家族是細胞凋亡的“執行者”,Caspase-3在細胞凋亡過程中發揮主要作用,其活化后對底物PARP (poly ADP-ribose polymerase) 的剪切被認為是細胞凋亡的一個重要依據。caspase-8 在外源凋亡途徑中發揮重要作用。結果顯示,加藥24 h 后,異戊酸心菊內酯引起了H1975、H1299 細胞中PARP 的剪切并產生降解片段,同時caspase-3、caspase-8 也出現剪切活化片段(圖4),說明異戊酸心菊內酯可誘導肺癌細胞發生凋亡。

表1 從鵝不食草中分離的10 個單體化合物Tab.1 Ten compounds isolated from C.minima

表2 阿里二醇、6-O-當歸酰多梗白菜菊素、異戊酸心菊內酯對不同肺癌細胞系的IC50值（μmol/L，，n=3）Tab.2 The IC50 values of arnidiol，6-O-angeloylplenolin，and helenalin-isovalerate for non-small cell lung cancer cell lines（μmol/L，，n=3）

表2 阿里二醇、6-O-當歸酰多梗白菜菊素、異戊酸心菊內酯對不同肺癌細胞系的IC50值（μmol/L，，n=3）Tab.2 The IC50 values of arnidiol，6-O-angeloylplenolin，and helenalin-isovalerate for non-small cell lung cancer cell lines（μmol/L，，n=3）

3.5 異戊酸心菊內酯對H1975 細胞增殖相關蛋白p-ERK、p-AKT 及核轉錄因子NF-κB 的影響 眾多研究表明,p-ERK (phospho-extracellular regulated protein kinases,細胞外調節蛋白激酶)、p-AKT(phospho-protein kinase B,蛋白激酶B) 在腫瘤細胞中高度表達,并且它的表達與腫瘤細胞增殖密切相關。NF-κB (nuclear factor kappa-B) 是一種核轉錄因子,存在廣泛,作為許多重要細胞的中央調節劑,在功能上,NF-κB 能調控大量先天性和適應性免疫反應過程,在細胞增殖、凋亡、炎癥及腫瘤的發生中扮演了重要角色。本研究發現(圖5),加藥24 h 后,異戊酸心菊內酯使H1975 細胞中p-ERK、p-AKT 蛋白表達水平顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),且呈濃度依賴性,而H1975 細胞中ERK、AKT 蛋白的本底表達水平沒有顯著變化。同樣加藥24 h 后,可見NF-κB 蛋白表達水平與對照組相比降低。說明異戊酸心菊內酯發揮抗腫瘤的作用可能與抑制p-ERK、p-AKT 及NF-κB 的表達有關。

圖3 異戊酸心菊內酯對H1299 細胞的凋亡誘導作用（，n=3）Fig.3 Helenalin-isovalerate induced H1299 cells apoptosis （，n=3）

圖4 異戊酸心菊內酯對凋亡相關蛋白的影響（，n=3）Fig.4 Effect of helenalin-isovalerate on the apoptosis-related proteins

圖5 異戊酸心菊內酯對H1975 細胞增殖相關蛋白的影響（，n=3）Fig.5 Effect of helenalin-isovalerate on the proliferation-related proteins in H1975 cells （，n=3）

4 討論

肺癌已成為全世界發病率最高、致死人數最多的惡性腫瘤,全球每年相關死亡人數達180 萬[10],在我國就有63.1 萬[11]。目前,肺癌的西醫治療手段主要包括手術、放化療、靶向治療、免疫治療等,取得一定效果,但非小細胞肺癌、小細胞肺癌的5 年生存率分別只有19%、6%[12],故研發有效的相關新型藥物是醫學界重要研究課題。我國擁有豐富的中藥資源,對其應用和研究有著悠久的歷史,開發抗肺癌相關藥物具有重要的臨床意義。

鵝不食草主要化學成分包括黃酮、萜類、揮發油、酚類、酚酸等[13-16]。本實驗所篩選出的3 種活性較好的化合物中,CM-19 為阿里二醇,關于其抗癌活性的研究很少,值得將來深入研究其作用及機理；CM-25 為6-氧-當歸酰多梗白菜菊素,是第1種Skp1 抑制劑,對STAT3 也有一定抑制作用,可導致癌蛋白NIPA、Skp2、β-TRCP 發生降解而對抑癌蛋白F 框/WD40 域蛋白基因(F-box and WD-40 domain-containing protein 7,FBXW7) 無作用,并在細胞與動物模型顯示較強的抗癌作用,包括抗非小細胞肺癌[7-8]、多發性骨髓瘤等[17]；CM-26 為異戊酸心菊內酯,它是倍半萜類化合物,對其活性的研究極少,但發現心菊內酯可抑制NF-κB 表達,繼而引起細胞自噬性死亡[18],或通過抑制NF-κB、促進反應性氧類產生而逆轉B 細胞淋巴瘤-2 (Bcell lymphoma 2,Bcl-2) 介導的凋亡抵抗[19]。本實驗發現,異戊酸心菊內酯可抑制肺癌細胞增殖,誘導caspase-3 依賴性的細胞凋亡,其作用機制可能與抑制了p-ERK、p-AKT、NF-κB 蛋白表達有關,表明鵝不食草含有多種抗癌物質,單體化合物的活性及其機理并不相同,它們聯合作用才能呈現總體抗癌活性。

鵝不食草作為一種傳統中藥,雖為2020 年版《中國藥典》 收錄,但其抗癌活性在臨床上未被檢測過。因此,結合前期研究結果[7-8,17-19],本實驗認為有必要開展鵝不食草用于肺癌等惡性腫瘤治療的臨床試驗,可單獨使用,也可與其他藥物聯用,以明確該藥材是否具有抗癌的臨床用途,并為相關治療提供新選擇。